不同砧木对塔罗科血橙果实抗氧化能力的影响*

陈招芳，黎思辰，杨镰聪，杨友婷，邓红红,，孙国超，汪志辉

(1.四川农业大学，果蔬研究所，四川 成都 611130；2.中国农业科学院 柑桔研究所，重庆 400712；3.四川农业大学 环境学院，四川 成都 611130)

柑橘产业现为四川省第一大水果产业，截至2019 年底，全省种植面积32.3 万hm2，其中晚熟柑橘约占中国晚熟柑橘栽培面积的60%，居全国首位[1]。近年来，四川省晚熟柑橘种植经济效益好，产业发展迅速。低温冻害是发展晚熟柑橘的主要限制因素之一。当种植柑橘的最低气温低于-5 ℃时，果实会出现明显冻害，表现为失水、褐化和脱落；若温度更低，植株甚至出现死亡[2]。FOYER 等[3]研究表明：植物可通过提高自身高效的抗氧化酶与抗氧化剂系统以维持细胞内活性氧(ROS)的动态平衡；KONDO 等[4]研究了低温对不同品种果实抗氧化剂及抗氧化活性的影响，结果表明：果实的抗氧化剂和抗氧化活性与抗低温能力密切相关；牛茹萱[5]建立了桃抗寒性综合评价体系，结果表明：可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和过氧化氢酶(catalase，CAT)均是评价抗寒性的参考指标；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)也在柑橘的抗寒性评价[6]中得到广泛研究。截至目前，已有许多研究证明以上物质与植物抗逆性存在密切关系[7-10]。

低温冻害是晚熟柑橘栽培中需面对的重要逆境之一，因此有必要提高果实的抗逆性来提高其抗氧化能力，而嫁接是提高柑橘果实抗逆性的重要途径之一。朱世平等[11]对国内外不同柑橘砧木的抗寒性进行了归纳和总结，表明优良砧木的选用能提高柑橘的抗寒性。CAO 等[12]研究表明：较高的抗氧化系统(SOD、CAT 和APX 等)有利于提高果实的抗低温能力；刘兴禄等[13]和王海鸥等[14]评价了不同砧木枝条的抗寒性，发现抗寒性强的砧木具有较高的渗透调节物质含量和抗氧化酶活性。目前，国内柑橘嫁接的砧木品种主要是枳(Poncirus trifoliateL.Raf)、红橘(Citrus reticulataBlanco)和香橙(C.junosSieb.ex Tanaka)，三者均在四川地区广泛种植，表现稳定、品质良好。血橙(C.sinensisL.Osbeck)属甜橙类，是具有代表性的晚熟柑橘之一，中国四川和重庆等地区广泛种植的血橙品种为塔罗科[15]。血橙果实富含多酚及类黄酮等活性化合物，具有高效的抗氧化和清除自由基等作用[16]。目前，前人对于酚类物质和保护酶的报道主要集中在果实采后研究和品种比较上，而有关不同砧木果实生长发育过程中酚类物质和保护酶活性的变化规律研究鲜有报道。

本研究以香橙、红橘和枳砧木嫁接的塔罗科血橙为试材，研究不同砧木果实发育过程中抗氧化物质(总酚和总黄酮)、渗透调节物质(可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸)和MDA 含量以及抗氧化酶(SOD、POD、CAT 和APX)活性的动态变化，旨在筛选出能够提高果实抗氧化能力的优良砧木，为塔罗科血橙抗低温砧木的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样品于2020 年7 月—2021 年3 月采自四川省自贡市富顺县甜橙品种资源圃(N29°11′30″，E105°10′43″)。供试材料为枳、红橘和香橙3 种砧木嫁接的8 年生塔罗科血橙各9 株，3 株为1 个小区，3 次重复。试验于2020 年7 月15 日开始采样，参考黄仁华等[17]的方法，将果实发育阶段分为幼果期、膨大期、转色期、成熟期和完熟期，依次在盛花后90、150、210、270 和330 d采样。每株在树冠外围东、南、西、北、中5 个方位采样，每个部位随机采取无病虫害、大小中等的果实各3 个。每次采集样品后用冰盒保存迅速运回实验室，去掉果皮，果肉切碎混匀后置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 总酚与总黄酮含量测定

总酚含量的测定参照Folin-Ciocalteus 法[18]，以没食子酸为标准品；类黄酮含量的测定采用硝酸铝比色法[18]，以芦丁为标准品。测定结果均以每克鲜样中所含标准品表示。

1.2.2 渗透调节物质及丙二醛含量测定

可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法[19]测定；可溶性糖含量采用蒽酮乙酸乙酯法[19]测定；脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮比色法[20]测定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[21]测定。

1.2.3 抗氧化酶活性测定

SOD 活性采用氮蓝四唑(NBT)光还原法[20]测定，在560 nm 波长下测定其OD 值，以抑制NBT光化学还原50%为1 个酶活性单位；POD 活性采用愈创木酚染色法[20]测定，以波长470 nm 下每分钟上升0.01 为1 个酶活性单位；CAT 活性采用紫外吸收法[20]测定，以波长240 nm 下每分钟减少0.1 为1 个酶活性单位；APX 活性参考CHU 等[22]的方法测定，以290 nm 下每分钟减少0.01 为1 个酶活性单位。测定结果均以每克鲜质量的活力单位表示。

1.3 数据分析

采用 Microsoft Excel 2010 和Adobe Illustrator 2020 整理数据并作图，采用 SPSS 23.0 软件进行差异显著性和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 塔罗科血橙生长发育时期的果实变化

由图1 可知：在果实发育过程中，果实体积逐渐增加，果实颜色逐渐由绿色转变为黄色，再转变为红色。相比于枳砧果实，香橙砧和红橘砧果实的转色速度更快，转色周期短。当果实达到成熟时，三者的果皮颜色无显著差异。

图1 血橙果实发育过程中果实颜色的变化Fig.1 Changes of fruit color in blood orange on different rootstocks during fruit development

2.2 不同砧木塔罗科血橙果实的抗氧化物质含量

由图2 可知：在果实发育过程中，3 种砧木果实的总酚和总黄酮含量均呈逐渐下降的趋势，三者的总酚含量最高值均出现在幼果期，此时香橙砧果实的总酚含量显著高于枳砧。相比于幼果期，完熟期香橙砧、红橘砧和枳砧的果实总酚含量分别下降61.52%、59.31%和67.80%。在花后90～150 d(幼果期—膨大期)，香橙砧和枳砧果实的总黄酮含量大幅度下降，而红橘砧的下降趋势较为平缓。当果实成熟时，红橘砧果实的总黄酮含量最高(0.94 mg/g)，香橙砧果实次之，而枳砧果实最低(0.52 mg/g)。在果实发育期间，3 种砧木果实的总酚和总黄酮含量差异较大，红橘砧果实的总酚和总黄酮含量高于或显著高于其他2 种砧木，而枳砧果实的总酚含量最低。

图2 不同砧木塔罗科血橙果实发育过程中总酚和总黄酮含量变化Fig.2 Changes of total phenols and total flavonoids contents in ‘Tarocco’ blood orange on different rootstocks during fruit development

2.3 不同砧木塔罗科血橙果实的渗透调节物质含量

由图3 可知：可溶性蛋白含量在3 种砧木的果实发育过程中均呈先降后升的变化趋势，在花后150 d(果实膨大期)，三者的可溶性蛋白含量均降到最低且差异显著；在果实完熟期，三者含量无显著差异。3 种砧木果实的可溶性糖含量整体呈上升的变化趋势，在花后90～150 d(幼果期—膨大期)，随着果实逐渐膨大，其可溶性糖含量快速升高，香橙砧、红橘砧和枳砧果实的可溶性糖含量分别增加0.52 倍、1.51 倍和1.37 倍；在花后150～270 d(膨大期—成熟期)，果实可溶性糖含量由高至低为红橘砧＞枳砧＞香橙砧；当果实达到完熟期时，三者含量相近。随着果实生长发育，脯氨酸含量呈上升趋势，在花后90～210 d(幼果期—转色期)，脯氨酸含量增加幅度较缓慢，随后增加幅度增大，其中枳砧的增加速度最快，三者均在完熟期达到最大值。在果实的发育过程中，香橙砧果实的可溶性蛋白和脯氨酸含量一直处于最低水平。

图3 不同砧木塔罗科血橙果实发育过程中渗透调节物质含量变化Fig.3 Changes of osmotic adjustment contents in ‘Tarocco’blood orange on different rootstocks during fruit development

2.4 不同砧木塔罗科血橙果实的丙二醛含量

由图4 可知：随着果实生长发育，3 种砧木果实中MDA 含量呈先下降后上升的变化趋势。枳砧果实的MDA 含量在膨大期降到最低，而香橙砧和红橘砧果实的MDA 含量均在转色期降到最低且两者间有差异。当果实成熟时，三者的MDA 含量有差异，其中香橙砧果实的含量最高；到果实完熟期时，香橙砧果实的MDA 含量(4.10 μmol/kg)显著高于红橘砧(2.11 μmol/kg)和枳砧果实(2.65 μmol/kg)。

图4 不同砧木塔罗科血橙果实发育过程中丙二醛含量变化Fig.4 Change of MDA content in ‘Tarocco’ blood orange on different rootstocks during fruit development

2.5 不同砧木塔罗科血橙果实的抗氧化酶活性

由图5 可知：在果实的发育过程中，3 种砧木果实的SOD 活性整体呈“降—升—降”的变化趋势，幼果期时三者的SOD 含量均最高，花后90～210 d(幼果期—转色期)SOD 活性急剧下降，果实成熟期时SOD 活性小幅增加。在果实发育过程中，3 种砧木果实的POD 活性表现为发育初期(膨大期—转色期)迅速下降，之后其下降速度逐渐减缓，最后则趋于稳定，至果实完熟期时POD 活性降到最低值；在成熟期，枳砧果实的POD 活性最高(30.40 U/g)，分别是香橙砧和红橘砧果实的12.97 倍和11.43 倍。3 种砧木果实的CAT 活性呈倒“V”形变化趋势，果实转色期CAT活性达到最高值且三者之间有显著差异，之后CAT 活性大幅度下降，并在完熟期降到最低值。3 种砧木果实的APX 活性与SOD 活性的变化趋势相近，即在幼果期活性最高，幼果期—转色期APX 活性急剧下降，此时红橘砧果实的APX 活性一直处于最低水平；随后三者的APX 活性在成熟期小幅度增加，并在果实完熟期降至最低值。此外，在果实发育后期CAT 与APX 活性均表现为红橘砧＞香橙砧＞枳砧。

图5 不同砧木塔罗科血橙果实发育过程中抗氧化酶活性变化Fig.5 Changes of antioxidant enzyme activity in ‘Tarocco’ blood orange on different rootstocks during fruit development

2.6 相关性分析

由表1 可知：果实的总酚与总黄酮含量极显著正相关，相关系数高达0.926，果实总酚与总黄酮含量都与3 种渗透调节物质呈显著或极显著负相关，而与SOD、POD 和APX 活性均存在极显著正相关。果实的3 种渗透调节物质含量也极显著正相关，与MDA 含量呈显著或极显著正相关，表明渗透调节物质会大量积累以减轻细胞膜的伤害；而3 种渗透调节物质与POD、SOD 和APX 活性呈极显著负相关，可溶性糖含量与CAT 活性呈显著正相关，可溶性蛋白和脯氨酸含量与CAT 活性相关性不显著。果实的4 种抗氧化酶活性均存在显著或极显著的相关性，表明抗氧化酶之间主要以协同作用为主，最大限度地防止氧自由基的毒害，其中SOD 与POD、APX 活性呈极显著正相关性，而SOD、POD、APX 都与CAT 显著或极显著负相关。

表1 不同指标的相关性分析Tab.1 Correlation coefficient between different indicators

3 讨论

酚类物质是植物在正常生长期间以及应激一些环境胁迫时所产生的重要次生代谢物质，是果实中重要的功能活性成分。在果实发育过程中，3 种砧木果实的总酚与总黄酮含量由高至低为红橘砧＞香橙砧＞枳砧，但三者均表现出幼果期的总酚和总黄酮含量最高，其后随着果实发育逐渐下降，这与前人对金柑[23]和猕猴桃[24]等的研究结果一致。MORALES 等[25]和宋伊真等[26]发现不同砧木果实的酚类物质含量有差异，本研究结果进一步验证了此结论。已有研究表明：总酚和总黄酮含量与抗氧化系统呈显著正相关[27-28]，与本研究结果一致，说明总酚与总黄酮是果实主要的抗氧化物质；但BOCCO 等[29]研究表明：柑橘果皮的酚类物质与抗氧化活性不存在显著相关性，可能是其果肉所含酚类物质种类少于果皮，或是其他抗氧化成分占主导地位参与了清除自由基的反应。

可溶性蛋白、可溶性糖和游离脯氨酸是重要的渗透调节物质，其含量升高能调节细胞渗透平衡以增加植物抗性，从而减轻逆境胁迫对植物造成的伤害[13]。王海鸥等[14]研究表明：葡萄砧木枝条的渗透调节物质含量总体上随温度降低而逐渐增加，但不同砧木品种枝条的抗寒性强弱各不相同；刘兴禄等[13]研究表明：随着温度降低，不同苹果砧木枝条的渗透调节物质含量变化波动较大且有差异。本研究也表明：在血橙果实发育过程中，可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量总体呈增加趋势，且不同砧木果实的渗透调节物质含量有差异。丙二醛是判断膜系统损伤程度的重要指标之一[30]。随着果实的生长发育，MDA 含量呈增加趋势，当果实达到成熟后，香橙砧果实的MDA 含量一直保持最高。

保护酶能够参与调控植物体衰老或逆境胁迫下细胞ROS 代谢，维持细胞代谢平衡。本研究表明：随着果实的生长发育，其SOD 和APX 活性总体呈下降趋势，但均在成熟期略有回升，推测其原因是随着11 月—次年1 月气温逐渐降低，SOD 和APX 活性升高可有效抵御低温环境。在幼果期，SOD、POD 和APX 活性最高，这可能与细胞新陈代谢旺盛、细胞增殖分化快以及细胞产生更多的O2-有关[9]。CAT 活性呈先升后降的变化趋势，这与李文欣等[31]的研究结果一致。由于果实逐渐成熟软化，果实细胞衰老，代谢产生的大量O2-使细胞相关抗氧化酶基因表达减少，抗氧化酶活性逐渐降低，MDA含量逐渐增加[31-33]。研究表明：不同砧木的抗氧化酶活性有差异，且抗寒性强的砧木品种能保持较高的酶活性[13,34]。本研究发现：不同砧木对果实的酶活性影响差异显著，且不同砧木的酶活性变化幅度明显不同，在果实发育前期，红橘砧果实的SOD、POD 和CAT 活性最高、香橙砧果实的APX 活性最高；在果实发育后期，红橘砧果实的CAT 和APX 活性最高，而SOD 和POD活性变化波动较大，推断3 种砧木果实的抗氧化酶活性由强到弱依次为红橘砧＞香橙砧＞枳砧。

4 结论

不同砧木果实发育过程中，总酚和总黄酮含量以及SOD、POD 和APX 活性均有明显的变化，总体上呈由高到低的变化趋势，CAT 活性变化趋势呈先升后降；而渗透调节物质和MDA 含量均逐渐增加。综合试验结果，认为红橘作为砧木时，果实的总酚、总黄酮和渗透调节物质含量较高，抗氧化酶活性更高，综合表现较佳，可作为塔罗科血橙抗氧化能力强的优良砧木。