不同生防菌剂组合及施用方式对马铃薯疮痂病的防治效果及促生作用

王鹏程，金光辉，张春雨，李 鑫

(黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江 大庆 163000)

【研究意义】马铃薯疮痂病是一种由疮痂链霉菌(Streptomycesscabies)引起的马铃薯世界性土传病害，该病集中在块茎形成期和膨大期侵染，块茎感染后在表面产生棕色或深色的痂状病变，严重时病斑聚结形成不规则的团块，覆盖块茎表面大部分区域，降低块茎品质，造成巨大的经济损失[1]。疮痂链霉菌是一种非特异性寄主病原体，发病机制复杂，在土壤中存活能力强，可通过风、水流或带病种薯传播，难以根除[2]。目前，主要采用化学药剂处理种薯、轮作及选择适宜抗性品种等方法对马铃薯疮痂病进行防治[2]。化学药剂防效不佳，常年使用不仅容易产生抗药性，还容易对环境造成污染；疮痂链霉菌在土壤中存活时间长，间隔时间5年以上，轮作困难。由于目前对疮痂链霉菌遗传多样性及不同马铃薯品种间的遗传差异研究较少[2]，国内仅鉴定出垦薯1号[3]、铃田红美[4]2个表现出高抗的品种，尚未发现或培育出完全抗性的商业化品种。因此，寻找高效、安全防治马铃薯疮痂病的方法具有十分重要的意义。【前人研究进展】近年来，国内外关于有益微生物防治马铃薯疮痂病已有报道。Han等[5]从马铃薯种植区土壤中分离出一株拮抗芽胞杆菌Bacillussp. Sunhua，在盆栽试验中疮痂病发病率从75%降至35%。St-Onge等[6]对Pseudomonassp.LBUM 223研究发现，其产生的抗生素(PCA)能够抑制S.scabies的生长及关键致病性基因的表达，具备生物防治潜力。郭凤柳等[7]与李勇等[8]分别鉴定出枯草芽胞杆菌B.subtilisB1与B.subtilisZWQ-1，盆栽试验明确其对马铃薯疮痂病有较好的防效。申永瑞等[9]从采集的马铃薯疮痂病的病害土壤中筛选出1株贝莱斯芽胞杆菌B.velezensisBU396，在盆栽试验中，采用1×109CFU/mL生防菌灌根60 mL，对马铃薯疮痂病的相对防效达到76.18%。目前有关马铃薯疮痂病生物防治研究鲜有报道。【本研究切入点】本研究所选用的3株生防细菌均筛选自黑龙江省马铃薯根际土壤，平板对峙试验表明，对马铃薯疮痂病有较好的拮抗作用，2018年盆栽试验筛选出几个对疮痂病有较好防治效果的生防菌复配组合。【拟解决的关键问题】本试验探究了生防菌的不同组合及拌种和土壤处理这2种施用方式对马铃薯疮痂病防治的影响，同时对株高、茎粗及产量指标进行了测定，探究其对植株生长的影响，以期为3株生防菌应用于马铃薯疮痂病的防治提供更多新的解决路径和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试马铃薯品种：盆栽试验与田间试验均为感病品种‘尤金’，该品种对Stretpomycesscabies敏感，发病严重且表型明显，由黑龙江八一农垦大学马铃薯研究所提供。

生防菌：枯草芽胞杆菌BacillussubtilisZD13-5、地衣芽胞杆菌B.licheniformisSD24-3及解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciensZD21-4由黑龙江八一农垦大学马铃薯研究所提供，生防菌粉由湖北中向生物工程有限公司提供，含量均为1011CFU/g。病原菌：马铃薯疮痂病菌S.scabiesKS28-2由黑龙江省农业科学院马铃薯研究所提供，黑龙江八一农垦大学马铃薯研究所保存。

1.2 供试培养基

酵母麦芽精琼脂(YME)培养基：酵母提取物4 g，麦芽糖10 g，葡萄糖4 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.2。

1.3 生防菌组合对马铃薯疮痂病的防治效果及促生作用

1.3.1 病原菌孢子悬浮液制备 采用划线法将疮痂病菌接种于YME培养基上，28 ℃暗培养15 d后，向培养皿倒入适量无菌蒸馏水，轻刮菌丝，制成孢子悬浮液，将同种菌株的孢子悬浮液混匀后调节浓度至107CFU/mL。

1.3.2 拌种剂制备 将含量为1011CFU/g的生防菌粉混入活性炭，制成浓度为109CFU/g的母剂，生防菌组合ZD13-5+SD24-3、ZD13-5+ZD21-4、SD24-3+ZD21-4按3∶3的比例混匀，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4按2∶2∶2的比例混匀制成拌种剂。

1.3.3 生防菌液制备 将含量为1011CFU/g的生防菌粉溶于无菌蒸馏水，制成浓度为109CFU/mL的母液，生防菌组合ZD13-5+SD24-3、ZD13-5+ZD21-4、SD24-3+ZD21-4按3∶3的比例混匀，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4按2∶2∶2的比例混匀制成生防菌液。

1.3.4 盆栽试验 为期2年的盆栽试验在黑龙江八一农垦大学进行，其中拌种处理分别于2018、2019年进行，基质处理仅在2019年进行，参照刘淑娜[3]的方法并略有调整，马铃薯种薯经0.1%的高锰酸钾浸泡15 min后，用无菌蒸馏水冲洗3遍，置于20 ℃恒温培养箱中催芽，至芽长0.5 cm左右，播种前切至50 g带1～2个芽眼的薯块。蛭石、珍珠岩、草炭土按1.0∶1.0∶2.0的比例混匀后灭菌，用作盆栽基质。在35 cm×35 cm的花盆中装入2.5 kg的基质，每盆加入150 mL浓度为107CFU/mL的病原菌孢子悬浮液，混匀后加入15 g复合肥(氮磷钾比例11∶23∶16)，覆盖0.5 kg基质后浇透水，按不同处理放入薯块并覆盖2.5 kg基质。试验设置9个处理，4个拌种处理按拌种剂：种薯按1∶100的比例质量比混拌均匀后播种；4个基质处理按m(生防菌液)∶m(种薯)=1∶5比例播种前用小喷壶均匀喷施在基质表面后播种，然后覆盖2.5 kg基质，1个对照，不做处理直接种入基质。处理1: CK；处理2:ZD13-5+SD24-3拌种；处理3:ZD13-5+ZD21-4拌种；处理4:SD24-3+ZD21-4拌种；处理5: ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌种；处理6:ZD13-5+SD24-3基质处理；处理7:ZD13-5+ZD21-4基质处理；处理8:SD24-3+ZD21-4基质处理；处理9: ZD13-5+SD24-3+ZD21-4基质处理。每个处理3个重复，每个重复3盆。出苗40 d后调查株高，茎粗，根长，根鲜重，9月25日进行收获，每盆单独收获后调查大中薯率、产量与病情指数并计算防效。

1.3.5 田间试验 试验于2019年在黑龙省农业科学院克山分院试验田进行，该试验田已经连续3年以上种植马铃薯，马铃薯疮痂病发病率超过70%。试验田春季起垄，行距80 cm，行长3 m，每区5行，每行种植12株，人工开沟播种。试验设置9个处理，4个拌种处理按拌种剂：种薯(质量比)1∶100的比例混拌均匀后播入沟中覆土，4个土壤处理按m(生防菌液)∶m(种薯)=1∶5比例播种前用小喷壶均匀喷施在沟中土壤表面，将块茎播入沟中覆土，1个空白对照，不做处理，直接将块茎播种入沟中覆土，采用随机区组试验设计。处理1: CK；处理2:ZD13-5+SD24-3拌种；处理3:ZD13-5+ZD21-4拌种；处理4:SD24-3+ZD21-4拌种；处理5: ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌种；处理6:ZD13-5+SD24-3土壤处理；处理7:ZD13-5+ZD21-4土壤处理；处理8:SD24-3+ZD21-4土壤处理；处理9: ZD13-5+SD24-3+ZD21-4土壤处理。设置3次重复，试验地四周设置保护行，试验于5月6日进行播种，田间常规管理，出苗40 d后调查株高、茎粗，9月30日收获，对小区中间3行逐株调查病情指数、大中薯率与产量并计算防效。

1.3.6 受害程度调查 病情调查的方法参照邢莹莹[10]、吴立萍[4]等的方法，块茎洗净晾干后调查每个重复的病斑面积等级和病斑深度等级(表1)，并计算病斑面积等级均值(MA)和病斑深度等级均值(MD)，并按下式计算病情指数(Scab Index，SI)。

表1 马铃薯疮痂病害分级标准

SI=(MA×MD)/20×100

1.3.7 生长指标测定 株高：测量植株地上最高主茎自地面到顶端部分长度。

茎粗：测量植株地上5～10 cm处的最大直径。

根长：测量植株最长根的长度。

根鲜重：挖出全部地面以下根系，洗净后晾干，测量鲜重。

大中薯率：收获后测定大中薯与小薯个数，计算大中薯率。其中大中薯标准为块茎质量≥75 g，低于75 g为小薯。

产量：收获后调查测产区产量，计算每公顷产量。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用Excel 2010和SPSS 17.0软件进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 盆栽试验防治效果

在2018和2019年的盆栽试验中，不同生防菌组合均对疮痂病有较好的防治效果，经拌种处理病情指数均显著低于对照(表2)。2018年3株生防菌组合防治效果最好，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4防治效果达80.68%，病情指数为3.89。ZD13-5+SD24-3病情指数显著高于其它生防菌组合，防治效果仅为36.52%；SD24-3+ZD21-4防治效果为79.25%，仅次于ZD13-5+SD24-3+ZD21-4。2019年病害发生程度较2018年高，各处理病情指数均有不同幅度提升，防治效果总体上也较2018年有所降低，其中ZD13-5+SD24-3+ZD21-4防治效果为74.68%，较2018年降低6%，病情指数为6.78，较2018年提高2.89；SD24-3+ZD21-4防治效果为68.33%，较2018年降低10.92%，病情指数为8.48，较2018年提高4.3。ZD13-5+SD24-3病情指数高于其它组合，达到14.59，较2018年提高1.81，防治效果为45.53%，较2018年提高9.01%。

表2 2018—2019年盆栽实验中不同处理对马铃薯疮痂病的影响

2019年的盆栽试验中，基质喷施不同组合生防菌同样对疮痂病有较好的防治效果，各处理病情指数均显著低于对照。ZD13-5+ZD21-4防治效果最好，达74.48%，病情指数为7.50；ZD13-5+SD24-3+ZD21-4 防治效果为71.08%，病情指数为8.50，仅次于ZD13-5+ZD21-4；ZD13-5+SD24-3防治效果低于其它组合，仅为44.98%。

使用生防菌拌种能显著降低马铃薯疮痂病危害程度，不同组合生防菌防治效果存在差异，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4防治效果最佳且较为稳定。生防菌拌种与基质处理均对马铃薯疮痂病有较好的防治效果，相同组合生防菌不同施用方式间防治效果无显著差异。

2.2 盆栽试验生防菌促生作用

不同处理对马铃薯的促生作用存在较大差异(表3)，SD24-3+ZD21-4无论拌种还是基质处理相较其他处理，均有较好的促生作用，与对照相比，SD24-3+ZD21-4拌种处理的株高增加28.89%，茎粗增加16.22%，鲜重增加36.69%；SD24-3+ZD21-4基质处理的株高增加21.50%，茎粗增加56.76%，鲜重增加35.29%，且均达到显著差异水平。ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌种和基质处理的株高、茎粗和鲜重均小于SD24-3+ZD21-4处理，但差异未达到显著水平。与对照相比，ZD13-5+SD24-3拌种处理的马铃薯鲜重增长率为负，与ZD13-5+ZD21-4拌种处理相比，茎粗的增长率相同，株高差异显著，ZD13-5+ZD21-4拌种处理马铃薯鲜重增长率为18.49%；与对照相比，ZD13-5+SD24-3和ZD13-5+ZD21-4基质处理的株高、茎粗和鲜重均有增长，且ZD13-5+SD24-3和ZD13-5+ZD21-4间差异不显著。与对照相比，除ZD13-5+ZD21-4和ZD13-5+SD24-3拌种处理外，其余处理均能显著增加根重，促进根发育，此外ZD13-5+SD24-3+ZD21-4基质处理还能显著增加根长。盆栽试验结果表明，菌株SD24-3、ZD21-4和ZD13-5可以通过增加株高、茎粗、根生长发育及块茎鲜重来促进马铃薯生长，不同施用方式对植株促生作用的影响在不同生防菌组合间存在差异，拌种和基质处理互有优劣，从块茎鲜重来看，不同施用方式对生防菌的促生作用无显著影响。

表3 2019年盆栽试验中不同处理对马铃薯的促生作用和产量影响

2.3 田间试验防治效果

在田间环境中，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4与SD24-3+ZD21-4拌种防治效果优于土壤处理(表4)，病害程度也低于土壤处理，其余处理不同施用方式对防治效果无显著影响。拌种处理中，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4防治效果最好(61.60%)，病害程度最轻；ZD13-5+SD24-3防治效果最差(11.35%)，病害严重程度与对照相比差异不显著。土壤处理中，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4病情指数显著低于对照，其余各处理与对照无显著差异，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4防治效果最好为35.48%，与拌种相比防治效果明显降低；ZD13-5+ZD21-4病害严重程度高于对照。结果表明，田间使用3株生防菌混合拌种防治效果优于土壤喷施，能较好防治马铃薯疮痂病。

表4 2019年田间试验中不同处理对马铃薯疮痂病的影响

2.4 田间试验生防菌促生作用

田间环境下，不同处理对马铃薯有一定的促生作用，但未达到显著水平(表5)。除ZD13-5+SD24-3外，各处理均对株高有一定的促进作用，其中ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌种处理的株高43.90 cm，明显高于对照，增长9.26%；ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌种处理、ZD13-5+SD24-3土壤处理及ZD13-5+SD24-3+ZD21-4土壤处理与对照相比，茎粗均增长9.09%。ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌种和土壤处理的产量分别达到36 937.50和39 262.50 kg/hm2，与对照相比分别增产26.28%和34.23%；此外，ZD13-5+SD24-3+ZD21-4拌种还能提高马铃薯大中薯率，与对照相比增加8.44%。ZD13-5+SD24-3拌种和土壤处理大中薯率较对照(56.23%)，分别提高13.82%和12.34%。结果表明，田间复杂环境下菌株SD24-3、ZD21-4和ZD13-5促生作用受一定影响。此外，菌株除促进马铃薯株高，茎粗外，还能促进马铃薯结薯及块茎膨大，从而促进马铃薯生长及产量提高。

表5 2019年大田试验中不同处理对马铃薯的促生作用和产量影响

3 讨 论

本试验选用的枯草芽胞杆菌ZD13-5、地衣芽胞杆菌SD24-3和解淀粉芽胞杆菌ZD21-4具有开发为混合菌剂的潜力，3株生防菌混配拌种使用防治效果最好，优于2株生防菌复配。研究表明生防菌混配可拓宽其适应范围，提高生防效果[11-12]。魏滟洁等[13]通过枯草芽胞杆菌B.subtilisJ2和球毛壳菌ChaetomiumglobosumND35混配，发现对黄瓜苗期枯萎病的防治效果优于单一生防菌；柳春燕等[14]将枯草芽胞杆菌(B.subtilis)和拟康氏木霉(Trichodermapseudokoningii)混配用于田间防治黄瓜枯萎病试验，得出2株菌混合具有一定协同作用的结论。刘大群等[15]研究拮抗链霉菌(Streptomycesstrains)防治马铃薯疮痂病表明，单株拮抗菌株防治效果,优于2株拮抗菌混配，与本结论相反；吕建林等[16]研究表明，将枯草芽胞杆菌(B.subtilis)与其他生防芽胞杆菌两两混接能显著提高对烟草青枯病的防治效果，最高达83.39%，但3株菌混接防效仅为45.49%，推测不同生防菌间除协同作用外可能还存在竞争关系。关于3株生防菌混配后对马铃薯疮痂病有较好防治作用的机理还需进一步研究。

本试验所用的生防菌不仅能有效防治马铃薯疮痂病，还能促进植株生长，提高作物产量。这与Wang等[17]的结果相类似，其通过9.5×108CFU/g枯草芽胞杆菌B.subtilisznjdf1和0.5×108CFU/g哈茨木霉Trichodermaharzianumznlkhc1随开沟播种时随种薯一起撒入沟槽，使病情指数降低30.6%～46.1%，产量增加23.0%～32.2%。Zhang等[18]通大田试验对拮抗菌株Streptomycessp.strain PBSH9进行了研究，研究表明PBSH9防治效果优于商品化链霉素，防效47.64%～73.97%，增产9.70%～15.93%。Sarwar等[19]发现链霉菌StreptomycesA1RT不仅可以产生Isatropolone C抑制多种疮痂病原菌，有效减少病害发生，还可以产生大量IAA来促进植株与块茎的生长发育。Sarwar等[20]还发现链霉菌StreptomycesviolaceusnigerAC12AB可以通过产生阿扎霉素 RS22A来减轻病害发生程度，还可以通过产生IAA、溶解磷酸盐、固氮等促进马铃薯生长发育。阿扎霉素具有广谱抗菌性[21]。芽胞杆菌作为植物根际促生长微生物的代表被广泛研究，同时可以防止病原菌侵染或诱导植物抗病。Bais等[22]发现B.subtilis6051在植株根部定殖后可以形成生物膜和分泌表面活性物质，共同保护植株免受病原菌侵染。解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens通过fengycin、surfactin等环状脂肽在内的多种广谱抗菌化合物抵御病原菌侵染[23-24]。地衣芽胞杆菌可产生3-甲基-1丁醇等挥发物对植物病原真菌产生抑制[26-27]。关于本文所用3株生防芽胞杆菌，通过何种方式促进植株生长和抵御病害发生有待进一步研究。

不同的施用方式可能对生防菌的生物防治及促生作用产生影响，综合本试验结果，田间拌种使用优于土壤喷施。这与Zhang等[29]的结果相类似，其发现拌种比土壤处理更适合PBSH9接种，同样，Dubey等[28]研究木霉菌防治绿豆根腐病发现种子处理效果均优于土壤施用。Martyniuk等[29]通过大豆土壤和种子接种根瘤菌，发现土壤接种比种子接种增产57%左右，与本文结论相反。Manzar等[30]研究发现木霉菌土壤施用和种子处理组合施用对高粱的促生作用优于单独施用；黎妍妍等[31]研究认为生防菌拌土围根对烟草青枯病的防治效果优于兑水灌根。以上研究表明，不同的生防菌选择合适的施用方式将有利于展现其应用效果。在田间使用中，生防菌还常与杀菌剂、有机肥等载体及栽培措施结合使用。此外，本试验所用生防菌田间防治效果均低于盆栽，可能由于田间条件复杂多变，受到诸如土壤性质，天气条件等因素的影响，使得结果不一定与盆栽相一致[32]。

综上所述，有关3株生防菌促生及防治作用的机理等待进一步研究，同时需要广泛的田间试验进一步明确3株生防菌在田间条件下的施用方式、稳定的防效，为今后开发应用混合生防菌剂防治马铃薯疮痂病提供理论基础和新的解决路径。

4 结 论

生防菌枯草芽胞杆菌ZD13-5、地衣芽胞杆菌SD24-3和解淀粉芽胞杆菌ZD21-4对马铃薯疮痂病有较好防治效果，同时能促进植株生长提高产量；适宜的生防菌混配可利用协同作用提高其效果；不同的施用方式会影响生防菌的实际效果，本试验表明种薯拌种比土壤喷施更适合马铃薯疮痂病防治，综合评价得出ZD13-5+SD24-3+ZD21-4种薯拌种效果最佳。