牛蒡子中木脂素类化学成分分析方法的研究进展

张小倩，张腾腾，卢宝伟，孟祥松，杨雨琴，安凤霞

（亳州学院 中药学院，安徽 亳州 236800）

牛蒡子（Fructus Arctii）为菊科植物牛蒡（Arctium lappa L.）的干燥成熟果实，又名恶实，大力子，始载于《名医别录》，为历代《中华人民共和国药典》收录。传统中医药理论认为牛蒡子性寒，味辛、苦，归肺、胃二经，具有疏散风热，宣肺透疹，解毒利咽的功效，主要用于风热感冒，咳嗽痰多，麻疹，风疹，咽喉肿痛，痄腮，丹毒，痈肿疮毒等。牛蒡为二年生草本植物，秋季果实成熟时采收，主产于吉林，辽宁，黑龙江，浙江等地。国外分布于日本及欧洲、伊朗、阿富汗、印度等国[1]。

牛蒡作为一种药食两用的植物，具有很高的经济价值。在日本，牛蒡的根被称为“东洋参”，深受当地人的喜爱，研究发现牛蒡根具有降血压、健脾胃、补肾壮阳的功效，近年来，牛蒡根也作为一种高档蔬菜出现在国内各大超市。牛蒡的种子（牛蒡子）作为传统中药，具有悠久的使用历史，关于牛蒡子最早的使用记录可以追溯到魏晋时期，其疗效显著，应用广泛。牛蒡子中化学成分的研究始于20世纪30年代，自1929年日本学者田•川越等首次在牛蒡子中分离出牛蒡子苷元和牛蒡子苷后，关于牛蒡子中化学活性物质的研究取得了重要的进展，目前已经从牛蒡子中分离纯化出100余种不同类型的天然产物。牛蒡子中化学成分种类复杂多样，主要有木脂素、油脂、挥发油、三萜、蛋白质、多糖等，其中木脂素类成分是牛蒡子的主要成分，中外学者也将其作为评价牛蒡子质量的标准，2020版《中华人民共和国药典》将木脂素类成分牛蒡子苷作为牛蒡子质量评价的指标，并规定其含量不得低于5.0%。牛蒡子中木脂素类成分具有较高的药理活性，现代药理研究表明，其具有抗炎、抗凝、抗肿瘤、抗氧化、抗糖尿病等活性[2-15]。为进一步阐明其药理活性，指导合理用药，发掘其中有潜力的活性成分，对其物质基础研究至关重要；不仅如此，近年来随着分离分析技术的提高，发现牛蒡子中仍含有大量的未知木脂素类成分，需要开展更深入的分离制备工作。

1 牛蒡子中木脂素类化合物的基本结构

木脂素（lignans）是一类由苯丙素单位（C6-C3）聚合而成的天然产物，通常指代的是二聚物，少数是三聚物或四聚物。由于组成木脂素的C6-C3单体缩合位置不同及其侧链γ-碳原子上的含氧基团相互脱水缩合等反应，形成了不同类型的木脂素。最早Haworth把C6-C3单元侧链通过β-碳聚合而成的化合物称为木脂素类，基本母核结构见图1，后来Gottlich把新发现的由其他位置连接生成的化合物称为新木脂素类（neolignan）化合物。

图1 木脂素母核

木脂素类成分作为牛蒡子中的主要成分，含量丰富复杂，迄今为止，从牛蒡子中分离出的木脂素类化合物已达60多个，且它们的基本母核相似，大多是以2个单元苯丙素（C6-C3）通过分β、γ缩合成一个五元环内脂（二苄基丁内脂）。

2 木脂素的分析方法

木脂素作为自然界中常见的一类组分，关于它的分析方法很多，如紫外-可见分光光度法、薄层色谱扫描法、液相色谱法、气相色谱法、超临界流体色谱法、毛细管电泳法以及各种联用技术等。在上述众多方法中，高效液相色谱法因其高效、快速，重复性好，稳定性高，适用范围广等特点，已成为木脂素的主要分析手段。2020版《中华人民共和国药典》关于牛蒡子质量标准中含量测定部分，就是采用高效液相色谱仪对牛蒡子中主要化合物牛蒡子苷进行含量测定。超临界流体色谱作为一种新型的色谱分析技术结合了液相色谱与气相色谱共同的优点，具有诸多优势，如快速、节约有机溶剂，适用范围广等优势，这些特点使其在天然产物的分析中具有独特的优势，故以下主要介绍液相色谱和超临界流体色谱以及由其发展衍生出的新技术在木脂素类化合物分析中的应用。

2.1 高效液相色谱法

液相色谱最早由俄国科学家茨维特（Tswett）在分离植物色素时发现，但是受当时仪器条件与分离材料的限制，并没有体现出其出色的分离能力。直到20世纪60年代，随着高压恒流泵应用到高效液相色谱仪上，高效液相色谱技术（High performance liquid chromatography，HPLC）才有了质的发展。如今，HPLC已成为分析天然产物最主要的方法之一，具有样品用量少、色谱柱可反复利用、易回收、自动化程度高、成本低等优势。根据HPLC中流动相与固定相极性大小的区别，将HPLC分为正相色谱（NPLC）和反相色谱（RPLC），木脂素极性相对较弱，在RPLC中具有很好的保留，利于木脂素的分析。木脂素类成分牛蒡子苷及其苷元为牛蒡子的主要化学成分，实现常采用RPLC对其进行分析，为了更深入的了解牛蒡子的质量，杨亮蕊[16]等采用RPLC对牛蒡子中牛蒡子苷及其苷元的含量进行了测定。实验采用Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相体系为甲醇：水，梯度洗脱条件：30%甲醇（0～5 min），30%～40%甲醇（5～6 min），45%甲醇（6～25 min），0.8 mL/min的流速，25 ℃的柱温，280 nm的检测波长。结果显示牛蒡子苷及其苷元均实现了较好的分离度，且整个分析在25 min内全部完成。

RPLC的保留机理主要是固定相与样品之间的疏水作用力，保留时间会随着被分析样品极性的增强而减弱。天然产物中的木脂素多以游离的形式存在，其极性相对较弱，在RPLC上保留较强，同时随着木脂素母核上羟基的增加，使样品极性增强，保留减弱。糖基化会使木脂素的极性大大增加，随着木脂素苷上连接的糖数量的增加，样品会变得慢慢溶于强极性溶剂，在RPLC上的保留较弱。此时，采用亲水色谱（HILIC）对其分析能够很好地解决这个问题，实现较好的保留[17-19]。

HILIC从液相色谱划分标准来看，可以认为是一种特殊的NPLC，但是它又兼容了RPLC的流动相优势。HILIC通常使用水和乙腈等作为流动相，相比NPLC的流动相可以部分解决强极性化合物的溶解性问题，而且又能很好的弥补RPLC对强极性化合物保留较差的不足。HILIC的分离机理也不同于传统液相色谱，目前比较成熟的理论认为HILIC的固定相表面会形成一层富水层，极性化合物会在这个富水层与流动相之间反复分配，进而实现各目标化合物的分离。植物化学研究者在对天然产物研究时，多是采用有机溶剂提取研究对象中的有效成分，而忽视了大量水溶性的成分，尤其在对中药有效成分研究时更应该多注意亲水性成分。牛蒡子水提液中存在大量绿原酸、咖啡酸等简单苯丙素类成分，这些成分可能是牛蒡子发挥抗病毒作用的主要成分，但是它们在RPLC上的保留并不理想。此时，采用HILIC对其分析可以实现一个较好的保留，刘瑶[20]等采用Waters XBridge BEH Amide（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）亲水色谱柱在亲水模式下测定了参附注射液中绿原酸、咖啡酸等有机酸的含量。实验条件为：40℃柱温，0.8 mL/min的流速，0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）作为流动相，梯度洗脱条件为0～10 min 2%～45% B。结果显示绿原酸与咖啡酸等有机酸在HILIC色谱柱上获得了较好的保留与分离。现在一些新型HILIC色谱填料不仅对强极性化合物有较好的保留，对于中等极性的化合物也能实现不错的保留[21]，大大弥补了RPLC分析的局限性，丰富了分析方法。如Click XIon色谱柱是在硅胶表面键合两性离子，极大地丰富了样品与固定相之间的保留机理，既包括传统的液液分配作用，又含有离子键等作用力。Xiujie Guo等[22]采用Click XIon色谱柱在亲水模式下分析人参皂苷，在甲醇：水的流动相体系下，各人参皂苷都获得了一个很好的峰形，得到了较好的保留和分离度。

检测技术是液相色谱中的重要部分，被分析样品的具体情况最终都是通过检测器捕集到样品信号反映出来。液相色谱中用于木脂素类化合物的检测器有很多，主要包括紫外可见光检测器（UV-vis）、二极管阵列检测器（DAD）、蒸发光散射检测器（ELSD）、核磁（NMR）以及质谱（MS）等，其中DAD与MS是木脂素检测时最常用的两种检测器。在早期木脂素的研究中主要是利用其苯环的紫外吸收，多数木脂素的两个取代芳环是两个孤立的发色团，其紫外吸收峰位置相似，吸收强度也具有加和性。一般在220～240 nm（lgε > 4.0）和280～290 nm（lgε 3.5～4.0）出现两个吸收峰。近年来MS作为一种高灵敏度的检测仪器在天然产物分析中的作用越来越大，将其与液相色谱联用在天然产物分析中有巨大优势。高效液相色谱-质谱联用技术（LCMS）是液相色谱与质谱技术的完美结合，它同时兼具了HPLC的分离能力和MS的灵敏检测能力，对复杂混合样品具有很高的选择性、灵敏度以及广泛的适用性。如S.C. Halls等[23]采用HPLC-DAD-MS对连翘中的多个木脂素进行定性定量研究，牛蒡子苷等7个木脂素化合物通过MS被鉴定出来，DAD检测器在280 nm下对各木脂素化合物具有很好的响应，轻松地实现了它们的定量工作。

2.2 HPLC新技术在木脂素分析中的应用

近年来液相色谱技术快速发展，超高效液相色谱（UPLC）的使用对木脂素类化合物的分析更加有利。根据范氏方程的理论，减小固定相的粒径可以降低涡流扩散，大大提高色谱柱柱效，利于样品的分离。1997年，Jorgenson[24]等将2 μm粒径的固定相应用于样品的分离分析，结果样品色谱峰展现出非常高的柱效，并体现出高效、快速的特点。小粒径填料的色谱柱虽然能够带来很高的柱效，但是整个系统的压力也会随之大大增加（超过6 000 psi），传统液相色谱仪已经不能满足如此高的压力。为了克服这种系统压力的限制，能耐受更高压力，具有更小死体积的UPLC应运而生。商业化的UPLC系统甚至可以承受高达18 400 psi的压力，可以匹配粒径1.3～2.5 μm等一系列的色谱柱。近十年来，UPLC的分析能力得到广泛认可，并广泛应用于木脂素类化合物的分离分析。Bharathi Avula等[25]开发了一种高效快速的UPLC-UV-MS的方法分析足叶草中4个木脂素（4-羟基去甲鬼臼脂素、α-盾叶鬼臼素、β-盾叶鬼臼素、鬼臼毒素），实验采用Acquity UPLCTM BEH C18（50×21 mm i.d.，1.7 μm）色谱柱，流动相体系为乙腈-水，并加入0.05%甲酸。4个木脂素类化合物仅在3 min内分析完成，各化合物的检测限分别为0.1、0.3、0.2、0.3 μg/mL。为了更好的说明UPLC分析木脂素的优势，将其与传统HPLC分析方法做了比较。首先查阅了关于足叶草中木脂素合适的HPLC分析方法，这些方法具有较高灵敏度和分辨率，然后统计比较这些HPLC方法[26-27]。发现常规的HPLC分析方法将足叶草中的4个木脂素类化合物分析完全需要25～35 min，且检测限在2.5～5 μg/mL之间。以上比较充分说明了UPLC在分析木脂素时具有快速、高效的特点。

天然产物成分复杂多样，一维液相（1D LC）色谱经常会因为自身选择性和峰容量不足而导致样品分离效果较差，使样品中各化合物的色谱峰挤在一起，无法分开，得不到满意的分离度。针对上述问题，基于不同分离机制的二维液相系统（2D LC）能够提供更好的选择性和更大的峰容量，解决复杂样品分离的难题。常见的二维液相色谱组成模式主要包括NPLC、RPLC、HILIC、离子交换色谱（IEC）、体积排阻色谱（SEC）等。从操作形式上又可以根据第一维馏分是否直接转移到第二维，将2D LC分为在线[28]和离线[29]两种模式。在线2D LC分析速度快，结果重复性好，但是对仪器设备的要求较高，需要特定的接口技术，操作难度也相应的增大。不同于在线模式，离线2D LC操作灵活性更高，对仪器要求简单，但是该方法人为因素过多，实验重复性稍差，而且样品容易损失与污染。Erni和Frei在分析复杂植物提取物时，因RPLC选择性不够，样品无法实现较好的分离，而将凝胶柱与反相柱联合使用来解决这种选择性不足的问题，并首次将这种分离模式名为2D LC。近年来，2D LC已经逐渐发展成熟，广泛的应用于多肽、蛋白质以及各类小分子化合物的分离分析和纯化制备[30]。邹汉法课题组[31]构建了一个二维反相色谱×反相色谱（2D RPLC×RPLC）用于川芎中多成分的分析，第一维RPLC模式采用氰基柱分析，流动相体系为甲醇-水，以0.04 mL/min的流速洗脱215 min，每5 min收集一次馏分；第二维也在RPLC模式下进行，采用ODS柱，乙腈-0.1%乙酸的流动相体系，每个组分均以0.7 mL/min的流速等度洗脱5 min，起始梯度随着第一维色谱柱洗脱梯度的变化适当优化。采用该2D RPLC×RPLC方法从川芎提取液中检测到120种化合物，结合质谱确定了其中的52个化合物，大大提高了川芎中化合物的检出能力，增加了对川芎基础物质的了解。

2.3 超临界流体色谱

超临界流体色谱法(supercritical fluid chromatography；SFC)是以超临界流体做流动相，依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程，是20世纪80年代发展起来的一种新技术[32]。SFC常用的流动相为超临界状态下的二氧化碳（CO2）及氧化亚氮（N2O），其中CO2因性质稳定、简单易得和不苛刻的超临界条件等优势被首选为SFC的流动相。处于超临界状态下的CO2既具有气体的低粘度，易于传质，又具有液体的高密度，利于溶解。因此使得SFC同时具有了GC和HPLC的特点，它既能分析GC不适应的高沸点、低挥发性样品，相比HPLC又具有更快的分析速度，是GC和HPLC的一种很好补充。虽然SFC具有分析速度快，分离效率高的优势，但是受仪器技术水平的限制，其发展缓慢，并没有得到广泛的应用。直到2012年，美国Waters公司重新整合设计了传统的超临界流体色谱仪，推出全新的超高效合相色谱（UPC2），为分离分析工作提供了一种全新超临界流体工具。全新的UPC2系统仍然是基于SFC的原理，并在此基础上结合超高效液相色谱仪的高压技术，使仪器能够耐受更高的压力，还能保证整个仪器的性能更稳定，突破了原有SFC系统压力波动大、低比例助溶剂时传输精度低以及灵敏度差等方面的瓶颈，并且能够使用小粒径的色谱柱填料，极大提高了分离效率[33-34]。

UPC2主要采用超临界状态下的CO2作为流动相，是一种经济的、绿色的分离分析技术。超临界状态下的CO2是一种非极性溶剂，对天然产物中的非极性化合物具有较好的溶解度和分离能力。UPC2可以使用色谱柱种类众多、范围广泛，其中使用最广泛的是硅胶色谱柱。由于UPC2固定相的种类涵盖了从极性的二醇基柱到非极性的C18柱等，使其分析范围广泛，对部分强极性化合物也能实现较好的保留与分离。但是临界状态下的CO2对极性化合物的溶解能力较差，在分析过程中需要加入一定比例的有机溶剂（如甲醇、异丙醇等）作为改性剂来增强其溶解能力和洗脱能力。不仅如此，对于一些样品遇到硅醇基发生拖尾时，也可以在流动相中加入一定量的有机酸来改善峰形。UPC2的保留机理与NPLC相似，但又不完全相同，李振宇等[35]考察了进样体积、流动相添加剂、改性剂、柱温和系统背压对UPC2保留行为的影响，被测定样品为吲哚类生物碱标准品。实验结果显示进样体积过大时会造成峰形分叉，可能是样品溶剂与流动相混合时不匹配引起的；随着流动相添加剂种类的改变，该类生物碱的保留和分离行为并无明显变化；改性剂的极性增加时，样品的保留减弱；柱温升高或系统背压降低都会使该类生物碱的保留减弱。通过上述条件的考察，作者优化UPC2的分析条件，并在15 min内完成了吲哚类生物碱的快速分析。由于UPC2的流动相用量少、安全环保、后处理简单，并且分析速度快，其在天然产物的分离分析及纯化制备中一定会起到越来越重要的作用。

3 结语

牛蒡子在我国药用历史悠久，疗效确切，具有广泛的药理作用。牛蒡子中化学成分主要含有木脂素、挥发油、三萜、油脂等，木脂素类成分是牛蒡子的主要成分，迄今已报道的牛蒡子中的木脂素类成分多达60多个。该药材价格低廉，但是疗效确切，具有较大的开发价值。牛蒡子中木脂素类化学成分分析方法目前有高效液相色谱法、HPLC新技术在木脂素分析中的应用、超临界流体色谱等。但是，目前关于牛蒡子中发挥主要作用的木脂素的研究工作，主要集中于牛蒡子苷与牛蒡子苷元这两个含量最高的化合物，对于其他微量木脂素的研究很少，也不够深入，其主要原因是较难获得纯度较高的这些化合物。为了对牛蒡子中木脂素类成分进行更深入的研究，进一步阐明其药理活性，需要获得纯度较高，质量足够的这些化合物，因此发展针对牛蒡子中木脂素的高效快速的分离纯化技术至关重要。