新生大鼠七氟烷暴露对发育期大脑创伤应激反应的影响与机制研究

陈本祯，江利华，李惠玲，张明强

(1.四川省妇幼保健院麻醉科，四川 成都610045；2.四川省医学科学院·四川省人民医院手术室，四川 成都 610072；3.成都中医药大学附属医院麻醉科，四川 成都610072)

七氟烷在小儿麻醉与镇静中的应用非常广泛，在许多动物实验中已经报道了新生期七氟烷麻醉或暴露导致的神经认知障碍。然而,由于人体在不同的生长阶段有许多复杂的环境应激因素，动物实验的结果是否可以直接转化为人类还有待研究[1～3]。对应激因素的神经内分泌反应失调与广泛的压力相关的神经精神后遗症有关,包括抑郁、创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)[4～6]。越来越多的研究表明,新生儿麻醉可能导致神经内分泌失调，并在以后的生活中应激反应增强[7,8]。啮齿类动物新生期麻醉暴露后的应激反应增强可能会加剧神经发育异常[9]。神经认知异常是由新生儿麻醉暴露的累积影响的结果,后来被疾病和/或各种心理社会压力等不良应激因素所放大。据报道，啮齿类动物在新生儿时期(出生后7天内)接受七氟烷暴露会导致类似自闭症谱系障碍(autistic spectrum disorder,ASD)的异常社会行为。ASD症候学的某些特征可能会使该群体更容易发生创伤暴露和PTSD的风险[10,11]。本研究采用经足电休克PTSD模型，探讨新生大鼠反复接触七氟烷是否增加应激暴露的风险，并加重青春期(生后33～46天)创伤后应激障碍的发生，以及研究新生儿大脑去极化γ-氨基丁酸A型受体(GABAAR)活动是否参与了这些异常的调节。

1 资料与方法

1.1 实验动物本研究时间为2021年3～7月，36只SD孕大鼠购自成都医学院实验动物中心，实验动物单独饲养在(24±1)℃的条件下，采用12 h 昼夜节律控制(光照从07∶00～19∶00)，实验动物均可自由进食和饮水。该研究经伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1分组方法 实验分为三组，新生期SD雄性大鼠随机分为七氟烷暴露组(SEV组)、七氟烷暴露+布美他尼预处理组(SEV+BUM组)及对照组，每组各12只。SEV组和SEV+BUM组大鼠在出生后第5、6、7天连续行2.1%七氟烷暴露2小时/天，建立新生大鼠七氟烷暴露模型。SEV+BUM组大鼠在每天七氟烷暴露前15 min给予腹腔注射布美他尼 1.82 mg/kg。SEV组大鼠在每日暴露前15 min给予等容积的生理盐水腹腔注射。对照组大鼠在出生后24、25和26天(青少年期)连续行七氟烷暴露2小时/天，建立七氟烷暴露模型。

1.2.2七氟烷暴露模型建立方法 将大鼠置于透明的呼吸环路暴露箱(5L)中，箱内装有干燥剂和二氧化碳吸附剂，并已提前调节好箱内七氟烷气体浓度。持续给予2.1%七氟烷+100% O2(2 L/min)(国药准字：H20070172，上海恒瑞医药有限公司)，观察实验鼠体位，呼吸及肤色，避免压迫，窒息等意外情况。暴露维持过程中，麻醉箱内气体浓度由持续监测多参数麻醉气体监护仪(Vamos ARTJ-0062，德尔格医疗设备上海有限公司)进行连续监测。暴露结束后，待实验鼠清醒30 min后放回笼中。SEV组和SEV+NUM组大鼠接受最后一次七氟烷暴露后，各取一批次(4只)大鼠立即通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)分析大脑前额叶皮质中NKCC1和KCC2的mRNA水平，并与对照组同期大鼠(4只)对照。

1.2.3建立经足电休克PTSD模型 各组其余批次大鼠在生后第31～34天(青春期)建立经足电休克PTSD模型，方法如下：自制条件恐惧箱，箱壁由透明有机玻璃组成，规格为36 cm×23 cm×48 cm。底部由 20根铜条组成，可以通电流，铜条直径约 0.5 cm，相邻两根铜条之间相隔1 cm。箱顶壁安装有扬声器，可以产生 4.5 kHz，60 dB的声音。将实验大鼠放入条件恐惧箱中，适应5 min，然后给予声音信号(4.5 kHz，60 dB，30 s)连续呈现 10 次，两次声音间隔时间为2 min，在第5次声音时与不可逃避的足底电击(1.2 mA，5 s)配对呈现，共6次。最后一次配对呈现后，大鼠在实验箱停留2 min，随后取出，送回动物房日常饲养。连续三天。大鼠出现僵立行为(只有呼吸、四肢僵立)即为条件恐惧性创伤应激模型建立。箱子在每次使用后均清洗干净，并用75%的酒精擦洗箱底。在条件反射试验两天后，对同一组大鼠进行消退训练，在具有不同视觉和触觉线索的环境中，经过两分钟的适应期后，接受6 × 2分钟的条件性刺激(CS)呈现(间隔2分钟)。记录每2分钟CS呈现时发生僵直反应的大鼠的比率(僵直反应的定义为除呼吸外的运动消失，呈木僵状态，僵直占比的计算方法为发生僵直反应的次数/CS呈现的次数)以测量恐惧记忆。每组各取一批次检测P31大鼠在条件恐惧作用前30 min和最后一次非条件刺激后5 min (after-us)的血清皮质酮水平。P33大鼠恐惧消退训练5 min后，测定血清皮质酮水平。血清皮质酮通过采用ELISA试剂盒(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI)测定。

1.2.4高架十字迷宫实验 各组余下的大鼠(每组各4只)在P35进行高架十字迷宫实验以评价其焦虑水平。迷宫由两个长、宽分别为30 cm×5 cm的开臂、两个长、宽、高分别为30 cm×5 cm×15 cm的闭臂组成，二者交接处是一个连接四只臂的中央平台(5 cm×5 cm)。该迷宫由1 cm厚的木板制成，四臂及中央平台均为黑色，整体固定于可升降的不锈钢支架上，迷宫底座调节距地面40 cm处。实验开始将大鼠置于迷宫中央头朝向开臂，通过摄像监视器垂直监视记录其活动情况，通过对比大鼠在开臂和闭臂内的滞留时间和路程来评价大鼠的焦虑水平。开臂停留时间百分比=开臂滞留时间/(开臂滞留时间+闭臂滞留时间)。每只大鼠测试5 min。每次实验结束后均用95%酒精湿布擦拭迷宫，继用干布擦净后再进行下一轮测试，以减少相互干扰。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验、单因素方差分析(两两比较采用Bonferroni 法)、双因素方差分析及重复测量方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大脑前额叶皮质NKCC1/KCC2 mRNA 表达水平比较SEV+BUM组大脑前额叶皮质NKCC1 mRNA表达高于对照组，低于SEV组(P<0.05)；SEV组大鼠大脑前额叶皮质中NKCC1 mRNA的表达显著高于对照组(P<0.01)。 SEV组大鼠大脑前额叶皮质中KCC2 mRNA 的表达与对照组比较，差异无统计学意义(P<0.01)。SEV组大鼠大脑前额叶皮质NKCC1/KCC2 mRNA 表达比率显著高于对照组(P<0.01)，SEV+BUM组大脑前额叶皮质NKCC1/KCC2 mRNA 表达比率显著低于SEV组(P<0.05)。见表1。

表1 三组大脑前额叶皮质NKCC1/KCC2 mRNA 表达水平比较

2.2 三组血清皮质酮分泌水平及焦虑水平比较SEV组大鼠基础血清皮质酮分泌水平以及第35天高架十字迷宫测试时的开臂滞留时间百分比和对照组比较，差异无统计学意义；SEV组大鼠在新生期重复接受七氟烷暴露，在青春期建立PTSD模型后血清皮质酮的分泌较对照组同期明显增加 (P<0.01)，高架十字迷宫测试中的焦虑水平明显增加(P<0.01)。见表2。

表2 三组血清皮质酮分泌水平及焦虑水平比较

2.3 三组恐惧消退和和重现测试比较SEV组大鼠在新生期接受重复七氟烷暴露后PTSD模型中的恐惧消退与复现测试中僵直占比明显高于对照组，SEV+BUM组大鼠PTSD模型中的恐惧消退和复现测试中僵直占比与对照组没有差异。SEV+BUM组大鼠在恐惧消退与复现测试中的僵直占比明显少于SEV组(P=0.018)，见表3。

表3 三组僵直占比比较(%)

3 讨论

本研究验证了新生期SD大鼠反复接触2.1%浓度七氟烷增加了应激暴露的风险，并加剧青春期PTSD的发展，同时还研究了新生儿大脑去极化GABAAR活动是否参与了这些异常的调节。七氟烷在小儿的最低有效肺泡浓度(MAC值)约为2.1%，我们实验设计选用该浓度类比七氟烷在临床麻醉与镇静实践中的常用剂量。本研究结果显示SD大鼠在新生期重复接受七氟烷暴露增强大脑GABAAR去极化活动并显著增加大脑前额叶皮质NKCC1 / KCC2 mRNA表达比率。SD大鼠新生期接受过重复七氟烷暴露并不影响其幼年期血清皮质酮基础分泌水平以及高架十字迷宫测试时的焦虑水平。但是，本研究通过幼年期SD大鼠经足电休克PTSD模型研究发现，大鼠在新生期而不是幼年期，重复七氟烷暴露增加在PTSD模型中的血清皮质酮的分泌，加剧了恐惧消退训练和回忆的缺陷，进而增加了高架十字迷宫测试时的焦虑水平。在七氟烷暴露前给予NKCC1抑制剂布美他尼预处理，可显著减轻这些反应。本研究表明，大鼠新生期反复接受七氟烷暴露加重其幼年期PTSD的发生与发展，其机制可能与新生儿大脑GABAAR去极化活动增强有关。

NKCC1/KCC2平衡失调与脑回路的过度兴奋有关，并导致广泛的应激相关神经认知障碍[12，13]。NKCC1在啮齿动物中的峰值表达大约在生后5～7天，这构成了未成熟神经元中GABAAR介导的去极化反应的分子基础。有研究报道，NKCC1在维持大脑GABA能传递功能和调节母婴分离导致的成年后生活应激易感性中发挥重要作用[14]。由于GABA受体介导的对LHPA轴活动的抑制是成熟大脑适应应激的重要机制[15]，成熟大脑基于GABAAR的应激适应机制可能导致新生儿大脑的相反的应激恶化效应。在本研究中，大鼠前额叶皮质中NKCC1/KCC2 mRNA比值在生后第7天接受完最后一次七氟烷暴露后立即增加，大鼠在幼年期PTSD模型中表现出的应激易感性也显著增加，在新生儿每次七氟烷暴露之前给予NKCC1抑制剂布美他尼预处理可显著缓解这种反应。

PTSD的焦虑特征是抑制恐惧的能力不足。恐惧消退可能涉及大脑前额叶皮质与海马、丘脑和新皮层通路的相互作用。本研究在PTSD模型的研究中发现，新生大鼠反复七氟烷暴露，可增加血清皮质酮的分泌，加重恐惧消退训练和回忆的缺陷，进而增加了高架十字迷宫测试时的焦虑水平。GABAAR是成熟中枢神经系统中主要的抑制性受体，但在神经发育早期至出生后早期阶段却作为兴奋性受体发挥作用[16]，在新生儿期反复七氟烷暴露增加了电脑GABAAR介导的去极化，这个时期过度的去极化会导致类似ASD的社交障碍。ASD患者可能存在PTSD发生的风险增加。本研究结果为麻醉相关神经认知功能障碍的治疗提供了一个新的潜在靶点。更重要的是，未来的研究应仔细探索生活中应激因素与七氟烷诱发的神经认知功能障碍之间的病因关系。