Ⅱ级生物安全柜校准装置的研建

程环，刘松竹，何春泽，何允刚，耿杰

（1.军事科学院军事医学研究院科研保障中心，北京 100850； 2.军事科学院军事医学研究院条件建设处，北京 100850）

生物安全柜是一种负压过滤排风柜，可防止含有病原微生物的气溶胶在实验操作过程中逸出造成生物气溶胶污染［1-3］。作为保护实验样本、环境以及实验人员的第一道屏障，生物安全柜的性能必须得到有效校准或测试，才能充分地保证实验样品、环境、及实验人员的生物安全［4-8］。国家计量技术规范JJF 1815—2020 《Ⅱ级生物安全柜校准规范》2020年正式实施，据调研军内只有极少数机构开展生物安全柜校准或测试，暂无校准标准，所以在军内建立生物安全柜校准标准非常重要［9-10］。

相较于欧洲标准EN 12469［11］、美国标准NSF 49等国外标准［12］，JJF 1815—2020 《Ⅱ级生物安全柜校准规范》［13］更为科学和完善，如表1所示。笔者依据JJF 1815—2020 《Ⅱ级生物安全柜校准规范》对Ⅱ级生物安全柜各项指标进行测量或校准。建立Ⅱ级生物安全柜校准装置，对生物安全柜下降气流流速、流入气流流速、气流流型、洁净度、人员、产品和交叉污染保护等进行测量，可以防止实验操作过程中产生的感染性微生物气溶胶对工作人员的威胁，防止生物安全柜以外的污染物进入安全柜对实验样品造成污染，防止试验操作过程中产生的气溶胶造成试验样品的交叉污染，对促进生物、化学等相关军事医学研究具有非常重要的意义［14-15］。

表1 生物安全柜标准参数表

1 标准装置的构成、工作原理或方法

1.1 主标准器及测量标准性能

风速仪：6501-BG型，编号为449547，测量范围为0～10 m/s，最大允许误差为±0.015 m/s（或示值的±3%），经计量确认符合要求，日本KANOMAX集团。

照度计：941型，编号为31910075，测量范围为0～1 500 lx，最大允许误差为±10%，经计量确认符合要求，美国Fluck公司。

声级计：AWA5636型，编号为351697，测量范围为30～130 dB，最大允许误差为±1 dB，分辨力为0.1 dB，有A计权模式，计量检定合格，杭州爱华仪器有限公司。

尘埃粒子计数器：3016型，编号为190902032，尘埃粒径测量范围为0.3～10 μm，计数测量范围为（10～100 000）/28.3 L，计数最大允许误差为±20%FS，经计量确认符合要求，朗豪贸易（上海）有限公司。

气溶胶光度计（化学介质）：2i型，编号为27575，测量范围为0.000 1～120 μg/L，示值最大允许误差为±10%，经计量确认符合要求，美国ATI公司。

生物安全柜质量检测仪（适用于碘化钾法）：ZR-1013型，编 号 为101320110150，流 量 为100 L/min，分辨力为0.1 L/min，流量最大允许误差为±2.0%，转速最大允许误差为±500 r/min，经计量确认符合要求，青岛众瑞智能仪器股份有限公司。

1.2 检测环境条件

温度：20～30 ℃；相对湿度：30%～65%。

1.3 测量标准装置的工作原理、方法及依据文件

依据JJF 1815—2020 《Ⅱ级生物安全柜校准规范》对Ⅱ级生物安全柜各项参数进行校准或测试。

1.3.1 下降气流流速

在工作区上方高于前窗操作口上沿100 mm的水平面上确定测量点位置，多点测量穿过该平面的下降气流流速。测量区域边界与安全柜的内壁及前操作口的距离为150 mm：测量点有3排，每排7个测量点，每个点重复测量3次，测量点等距离分布，形成的正方形栅格不大于150 mm×150 mm。测试区域边界与安全柜的内壁及前操作口的距离不小于150 mm。用夹具将风速仪探针准确定位在各测量点进行测量。记录所有测量点测量值，计算平均下降气流流速。

1.3.2 流入气流流速

安全柜前窗开启至标称高度；用风速仪在前操作口平面的两排点测量气流流速，第一排在前窗操作口上沿下约开启高度25%的位置，第二排在前窗操作口上沿下约开启高度75%的位置；测量点间隔约100 mm，距前操作口的侧边接近但不小于100 mm测试，每排7个测量点，每个测量点重复3次，记录每个点流速，计算平均值，用所有测量平均值表示流入气流流速。

1.3.3 照度

在安全柜工作台面上，沿台面内侧壁中心连线设置照度测量点，测量点距离不超过300 mm，与侧壁最小距离为150 mm，关掉安全柜照明灯，使用照度计从一侧起一次在各测量点测量背景照度，每个测量点重复测量3次；打开安全柜的照明灯，启动风机，依次在各测量点测量照度，每个测量点重复测量3次。计算背景照度和工作时照度平均值。

1.3.4 噪声

将声级计设置为“A”计权模式；打开安全柜照明及风机，在正常工作状态下，在安全柜前面中心水平向外300 mm，且距工作台台面380 mm处测量噪声，重复测量3次。关闭安全柜风机照明及风机，如有室外排风机，让其继续运行，在相同位置测量背景噪声，重复测量3次。计算背景噪声平均值。当背景噪声平均值不大于60 dB时，实际噪声为实测平均值。当背景噪声平均值大于60 dB时，实测值参照仪器操作手册提供的曲线或表进行修正，如不满足，应由校准曲线或下表进行修正，噪声为实测平均值减去修正值。噪声测量值修正如表2所示。

表2 噪声测量值修正表

1.3.5 洁净度

安全柜开机10 min ；洁净度的采样边界距离内表面或前窗100 mm，尘埃粒子计数器的采样口置于前工作台面向上200 mm的位置。采样点位于工作台面四角及中心，每个采样点重复采样3次，最小采样量为8.5 L/次。计算每个采样点粒子浓度平均值和总平均值的95%的置信上限（UCL），计算结果为洁净度测试结果。

1.3.6 高效过滤完整性

运行生物安全柜，使用气溶胶发生器在高效过滤器上游产生符合浓度的气溶胶（DOP等）气体，使用气溶胶光度计扫描高效过滤器下游，计算漏过率。

1.3.7 气流模式

烟雾分别沿工作区中心线、观察屏后、前窗操作口周边以及安全柜前玻璃窗内部两侧壁之间经过，记录烟雾流动。

1.3.8 人员保护（碘化钾法）

使用生物安全柜质量检测仪在安全柜工作区摆放气溶胶发生器与干扰圆筒，在安全柜外部摆放空气采样器，启动安全柜并运行至正常状态，空气采样器吸气，气溶胶发生器使20 mL的碘化钾气溶胶化，气溶胶化结束15 s后空气采样器停止吸气，将采样器过滤膜放入氯化钯溶液，对过滤膜上的棕色斑点进行计数，计算保护性能。重复试验3次，每次试验结果都应符合要求。

1.3.9 产品保护（碘化钾法）

使用生物安全柜质量检测仪在安全柜工作区摆放空气采样器与干扰圆筒，在安全柜外部摆放气溶胶发生器，启动安全柜并运行至正常状态，空气采样器吸气，气溶胶发生器使20 mL的碘化钾气溶胶化，气溶胶化结束15 s后空气采样器停止吸气，将采样器过滤膜放入氯化钯溶液，对过滤膜上的棕色斑点进行计数，计算保护性能。重复试验3次，每次试验结果都应符合要求。

1.3.10 交叉污染保护（碘化钾法）

使用生物安全柜质量检测仪，在工作区规定位置摆放气溶胶发生器与采样器，按产品保护测试方法重复试验3次，每次试验结果都应符合要求。

2 标准装置的重复性、稳定性试验及不确定度评定

2.1 测量标准的重复性测试

对生物安全柜质量检测仪、风速仪、照度计、声级计、尘埃粒子计数器、气溶胶光度计的关键指标进行6次重复性测量，均用公式（1）计算测量值的标准偏差SR来表征其重复性。测试结果列于表3。

表3 重复性测试结果

式中：xi——每个测量点实际测量值；

n——测量次数(n=6)。

由表3可知，各关键指标均符合计量要求。

2.2 测量标准的稳定性考核

2.2.1 生物安全柜质量检测仪的稳定性考核结果

每隔一个半月左右，分别对生物安全柜质量检测仪、照度计、风速仪、声级计、尘埃粒子计数器、气溶胶光度计进行6次重复性测量，取其算术平均值作为每组的测量结果，共测量4组，按照公式(2)计算极差sm，表征其稳定性，测量值及计算结果分别列于表4、表5、表6。

表5 照度计稳定性测试结果

表6 风速仪、声级计、尘埃粒子计数器、气溶胶光度计稳定性测定结果

式中：xmax——测定结果中的最大值；xmin——测定结果中的最小值；dm——极差差数，dm=2.06。

由表4、表5、表6可知，生物安全柜质量检测仪流量、照度、风速、噪声稳定性sm均小于最大允许误差，尘埃粒子计数器、气溶胶光度计的粒子浓度示值误差均小于各自的最大允许误差，以上各指标的稳定性均符合要求。

2.3 测量标准的不确定度评定

2.3.1 不确定度来源及计算方法

不确定度来源包括：

（1）测量重复性引入的标准不确定度uA。在实际测量中，每个点测量3次，取3次的平均值作为最佳估计值，按照均匀分布计算，取包含因子k=，因此重复性引入的不确定度分量uA=SR/k，其中各指标的SR由表2可知。

（2）分辨力引入的标准不确定度u1。由1.1可知各仪器分辨力并计算分散区间半宽a，按均匀分布计算，取包含因子k=，则u1=a/k。

（3）最大允差引入的标准不确定度u2。由1.1可知各标准仪器的最大允差b，按均匀分布计算，取包含因子k=，则u2=b/k。

2.3.1 安全防护测量标准（生物安全柜质量检测仪）不确定度评定

按照2.3.1分别计算不同的采样器在流量为100 L/min时的不确定度分量，计算结果列于表7。

表7 生物安全柜质量检测仪测量标准不确定度评定 L/min

2.3.2 气流流速测量标准（风速仪）不确定度评定

按照2.3.1分别计算风速仪在测量点为0.5、1.0 m/s时的不确定度分量，计算结果列于表8。

表8 风速仪测量标准不确定度评定 m/s

2.3.3 照度测量标准（照度计）不确定度评定

按照2.3.1分别计算不同照度测量点的不确定度分量，计算结果列于表9。

表9 照度仪测量标准不确定度评定 lx

2.3.4 噪声测量标准（声级计）不确定度评定

按照2.3.1分别计算声级计在测量点为94、114 dB测量点的不确定度分量，计算结果列于表10。

表10 噪声测量标准不确定度评定 dB

2.3.5 洁净度测量标准（尘埃粒子计数器）不确定度评定

表11 尘埃粒子计数器测量标准不确定度评定 L1)

2.3.6 高效过滤器检漏测量标准（气溶胶光度计）不确定度评定

按照2.3.1计算各不确定度分量，其中，在计算气溶胶光度计浓度示值重复性引入的不确定度分量uA时，按照2.1方法分别计算测量点为8～12 μg/L时的标准偏差来表征其重复性，按照均匀分布计算，取包含因子k=，则重复性引入的不确定度分量uA=0.011 μg/L。各计算结果列于表12。

表12 气溶胶光度计测量标准不确定度评定 μg/L

3 测量标准性能的验证

测量标准性能用最大允差表示，采用检定（校准）法进行验证。各标准器均送高一级测量标准进行检定或校准，检定或校准结果均符合测量标准性能要求，具体结果如表13所示。

表13 各标准器校准结果

4 测量结果的测量不确定度评定

Ⅱ级生物安全柜测量过程中涉及的参数主要有下降气流流速、流入气流流速、洁净度、照度和噪声等，这5个参数均使用标准器进行直接测量，且测量结果受温度、湿度、气压等环境因素的影响，可以忽略。因此，笔者主要分析在测量过程中对测量结果影响较大的不确定度分量来源，对其进行不确定评定。

4.1 计算模型

式中：i——第i个测量点；

j——某测量点的测量次序；

n——测量点的数量；

Xij——每个测量点测量值。

合并样品标准偏差sR计算方法：

Xij——第i个测量点第j次的测量值；

m——测量点的数量；

n——每个测量点包含的测量次数。

不确定度来源及计算方法同2.3.1。

4.2 下降气流流速不确定度评定

按照1.3.1方法测量风速，结果列于表14。

表14 风速测量值 m/s

按照公式(2)、(3)计算标准偏差，其中m=21，n=3，计算得到单次测得值的标准偏差sR=0.005 m/s，代入2.3.1（1）方法，计算得到重复性引入的不确定度分量uA=0.003 m/s；分辨力引入的不确定度分量u1=0.002 9 m/s；最大允差引入的不确定度u2=0.008 7 m/s。

4.3 流入气流流速不确定度评定

按照1.3.2方法测量风速，结果列于表15。

表15 风速测量值 m/s

按照公式(2)、(3)计算标准偏差，其中m=14，n=3，计算得到单次测得值的标准偏差sR=0.005 m/s，代入2.3.1（1）方法，计算得到重复性引入的不确定度分量uA=0.006 m/s；分辨力引入的不确定度分量u1=0.002 9 m/s；最大允差引入的不确定度u2=0.011 5 m/s。

4.4 照度测量结果不确定度评定

按照1.3.3方法计算照度，结果列于表16。

表16 照度测量结果 lx

按照公式(2)、(3)计算标准偏差，其中m=6，n=10，计算得到单次测得值的标准偏差sR=2 lx，代入2.3.1（1）方法，计算得到重复性引入的不确定度分量uA=1.15 lx；分辨力引入的不确定度分量u1=0.29 lx；最大允差引入的不确定度u2=49 lx。

4.5 噪声测量结果不确定度评定

按照1.3.4方法测量噪声，按照公式(4)、(5)计算总噪声，结果列于表17。式中：N——实际噪声测量值，dB；

表17 噪声测定结果 dB

Ni——总噪声单次测量值，dB；

Ni'——背景噪声单次测量值，dB。

按照公式(1)计算标准偏差，其中xi替换成Ni，替换成，n=10，计算得到单次测得值的标准偏差SR=0.5 dB，代入2.3.1（1）方法，计算得到重复性引入的不确定度分量uA=0.29 dB；分辨力引入的不确定度分量u1=0.029 m/s；最大允差引入的不确定度u2=0.6 dB。

4.6 洁净度测量结果的不确定度评定

按照1.3.5方法测量噪声，按照公式(6)、(7)、(8)、(9)计算洁净度，结果列于表18。

表18 洁净度测量结果 m-3

Mij——每个采样点单次采样粒子浓度，m-3；

n——采样点的数量；

s——采样点平均值的标准差，m-3；

95%UCL——总平均值得95%置信上限，m-3；

t0.95——计算95%置信上限所用的t分布值。

按照2.3.1（1）方法，计算得到重复性引入的不确定度分量uA=0；分辨力引入的不确定度分量u1=0.29 m-3；最大允差引入的不确定度u2=0.12 m-3。

5 结语

依据JJF 1815—2020 《Ⅱ级生物安全柜校准规范》，对风速仪、照度计、声级计、尘埃粒子计数器、气溶胶光度计、气溶胶发生器、生物安全柜质量检测仪标准装置进行重复性试验、稳定性考核和性能验证，并对测量标准和校准项目的相关技术指标进行不确定度评定及验证，各标准器、校准装置及配套设备，各项技术指标均符合计量要求。另，实验室环境条件合格，校准人员具有相应资质和能力，符合开展Ⅱ级生物安全柜校准的要求。