辣木茶多酚提取工艺优化及其体外抗氧化活性

余 芳，汪洪涛，郑梦瑶，朱龙龙

（1. 江苏经贸职业技术学院健康学院，江苏南京 211168；2. 江苏省食品安全工程技术研究开发中心，江苏南京 210000；3. 南京诺卫检测有限公司，江苏南京 211168）

0 引言

辣木（Moringa oleifera Lam） 为辣木科辣木属植物，我国南方地区多有种植。辣木叶和辣木籽是极具开发潜力的新资源食品，具有降低血压和胆固醇、抗氧化、抑菌、辅助减肥等作用[1-3]。辣木鲜叶在印度被当成蔬菜食用，在我国主要做成茶叶饮用[4]。辣木籽具有丰富的营养价值，其蛋白质含量为35.8%，多糖含量为19.1%[5]。辣木茶是新鲜辣木叶经过清洗、晾晒、摊凉、萎凋、杀青、摊凉、渥堆、揉捻、烘干等工艺制成，采用类似茶叶冲泡（浸泡或煮） 的方式供人们饮用的产品[6-7]。辣木茶富含蛋白质、多酚类物质及矿物元素[8-10]，能够降低老年人的尿酸水平[11]，对氯氰菊酯诱导的雌性大鼠肝肾功能损伤、氧化应激及组织病理学改变的保护作用，对·OH 和·O2-具有较强的清除作用[12-14]。

目前，有学者研究了辣木叶多酚提取及抗氧化活性[15-16]，辣木叶发酵制成的辣木茶生物活性研究较少。试验以市售辣木茶为原料，参照人们日常饮茶的生活习惯，通过高温水提的方式，考查料液比、提取温度、提取时间对辣木茶多酚提取量的影响。采用单因素试验和Box-behnken 响应面试验，优化辣木茶多酚提取工艺，选择最佳提取工艺参数。测定清除DPPH 自由基能力、超氧阴离子清除能力及总还原力，评价辣木茶溶液体外抗氧化活性，以期深入开发利用辣木保健茶资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣木茶，市售，产自云南昆明，水分含量5.8%，经高速万能粉碎机粉碎后，密封储存于冰箱-18 ℃冷冻层备用；没食子酸标准品、福林酚试剂、Tris-HCl、维C 标准品、DPPH 等，均为分析纯。

1.2 仪器设备

FW100 型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司产品；BSA224S 型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；JH 722s 型可见光分光光度计，上海菁华仪器仪表有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 辣木茶多酚含量测定

按照《GB/T 8313—2018 茶叶中茶多酚及儿茶素类检测方法》[17]，配制没食子酸标准储备液和系列标准溶液，加入10%福林酚试剂5 mL，摇匀，反应5 min，再加入7.5% Na2CO3溶液4 mL，室温静置60 min，于波长765 nm 处测定吸光度，得到回归方程Y=0.246 4X+0.042 2，R2=0.998 8。该测定方法线性关系良好，依此进行辣木茶多酚含量测定。

1.3.2 辣木茶多酚提取工艺单因素试验

称取辣木茶粉2 g，固定温度70 ℃，浸提时间30 min，设定料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60；固定料液比1∶30，温度70 ℃，设定提取时间10，20，30，40，50 min；固定料液比1∶30、浸提30 min，设定提取温度50，60，70，80，90 ℃，测定辣木茶多酚提取量。

1.3.3 辣木茶多酚提取工艺响应面试验设计

根据1.3.2 单因素试验结果，设计Box-behnken响应面试验，以辣木茶多酚提取量为考查指标。

Box-behnken 中心组合设计因素与水平设计见表1。

表1 Box-behnken 中心组合设计因素与水平设计

1.3.4 辣木茶体外抗氧化试验

（1） 辣木茶清除DPPH 自由基能力测定。分别称取0，0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 g 的辣木茶粉，加入80 ℃水溶解，冷却后定容到100 mL，配制质量浓度分别为0，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 mg/mL 的辣木茶溶液，过滤取滤液，根据Vattem D A 等人[18]方法对其进行DPPH 自由基清除率测定，以相同浓度的维C 溶液为阳性对照，并按下式计算不同溶液对DPPH 自由基的清除率。

式中：A0——2 mL DPPH+2 mL 70%乙醇溶液于波长517 nm 处测得的吸光度；

Ai——2 mL DPPH+2 mL 辣木茶溶液于波长517 nm 处测得的吸光度；

Ai0——2 mL 70%乙醇溶液+ 2 mL 辣木茶溶液于波长517 nm 处测得的吸光度。

（2） 辣木茶对·O2-的清除能力测定。取1.3.4（1） 相同质量浓度的辣木茶溶液，进行·O2-的清除能力测定，以相同质量浓度的维C 溶液为阳性对照。参照张秀芬等人[14]方法，配制0.05 moL/L，pH 值8.2的Tris-HCl 溶液、45 mmoL/L 邻苯三酚溶液备用。于10 mL 试管中依次加入试剂，反应4 min，测定波长340 nm 处不同样品液的吸光度，按式计算·O2-清除率：

式中：A0——2.55 mL Tris-HCl+0.05 mL 邻苯三酚+0.4 mL 蒸馏水于波长340 nm 处测得的吸光度；

A1——2.55 mL Tris-HCl+0.05 mL 邻苯三酚+0.4 mL 辣木茶溶液于波长340 nm 处测得的吸光度；

A2——2.55 mL Tris-HCl+0.4 mL 辣木茶溶液+0.05mL 蒸馏水于波长340 nm 处测得的吸光度。

（3） 辣木茶总还原力测定。分别称取0，0.020，0.040，0.060，0.080，0.100 g 的辣木茶粉，加入80 ℃水溶解，冷却后定容到100 mL，配制成0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL 的辣木茶溶液，过滤后进行总还原力测定，以0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/mL 维C 溶液为阳性对照。参照裴斐等人[15]方法，取不同质量浓度的样品液1.0 mL，测定其波长700 nm 吸光度。

1.4 数据处理

利用Design Expert 8 软件对试验数据进行回归拟合，p<0.05，差异显著；p<0.01，差异极显著。测定结果均平行重复3 次，取其平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

料液比对辣木茶多酚提取量的影响见图1，提取时间对辣木茶多酚提取量的影响见图2，提取温度对辣木茶多酚提取量的影响见图3。

图1 料液比对辣木茶多酚提取量的影响

图2 提取时间对辣木茶多酚提取量的影响

图3 提取温度对辣木茶多酚提取量的影响

由图1 可知，随着料液比的增大，辣木茶多酚提取量在不断增大，1∶40 时多酚提取量达到最高值，这是由于溶剂用量增加有利于多酚的溶出。随着料液比从1∶50 开始，提取量有所下降，说明随着溶剂量的增加，提取过程中溶出的其他水溶性物质如多糖等，影响了辣木茶多酚的提取分离。由图2可知，20 min 时达到最大提取量，表明提取液中多酚已基本溶出，提取时间过长会导致茶多酚被氧化而降低[14]。依据日常饮茶习惯的时间间隔，以及多酚的变化规律，选择水提时间10，20，30min 作为响应面试验的3 个水平。由图3 可知，随着温度的升高，溶液的分子运动加快，多酚的溶解度不断增大，且高温导致细胞膜破损，有利于有效成分的溶出[19]。温度选择要考虑到日常沏茶常用水温度及饮茶习惯温度。

2.2 辣木茶多酚提取工艺响应面试验

依据单因素试验进行辣木茶多酚提取工艺的Box-behnken 响应面试验，按照表1 的设计方案，以辣木茶多酚提取量为考查指标，17 个不同组合的试验结果。

Box-behnken 响应面法试验结果见表2。

表2 Box-behnken 响应面法试验结果

2.3 响应面回归模型的方差分析

应用Design Expert 8 软件对表2 的试验结果回归拟合，得到A、B、C 各因素对辣木茶多酚提取量（Y） 影响的二次多项回归模型方程：

回归模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析

由表5 可知，F=20.99，p=0.000 3<0.01，回归模型显著，拟合程度和可信度较好，试验误差较小，极显著。其中，料液比和提取温度2 个因素对辣木茶多酚提取量的影响极显著，模型失拟项不显著（p=0.758 8>0.05），则此模型拟合度良好。

2.4 提取工艺条件的响应曲面分析

根据Design Expert 8 软件对表4 数据进行回归拟合分析，得到不同提取条件对辣木茶多酚提取量影响的三维响应面图。

两因素的交互作用对辣木茶多酚提取量的影响见图4。

图4 两因素的交互作用对辣木茶多酚提取量的影响

由图4 可知，两因素的交互作用对辣木茶多酚提取量的影响，分析3 个响应面曲线图可知，料液比与提取温度2 个因素对辣木茶多酚提取量的影响显著，曲线较为陡峭，提取时间对辣木茶多酚提取量的影响较小，曲线较为平缓。

2.5 提取参数优化及模型验证

应用Design Expert 8 软件进行最佳提取条件为料液比1∶42.12，提取时间19.35 min，提取温度83.81 ℃，多酚提取量为32.13 mg/g。提取工艺修正为料液比1∶40，提取时间20 min，提取温度80 ℃。在此优化条件下提取辣木茶多酚，实际提取量为31.67±1.48 mg/g，与理论值非常接近，说明该多元二次回归方程能够准确预测辣木茶多酚的实际提取量。Fombang E N 等人[20]利用响应面法优化提取条件温度、料液比和时间，制备具有抗氧化潜力的富含植物化学的辣木功能性茶为料液比1∶20（mg∶mL），提取温度97 ℃，提取时间35 min，总多酚的最佳提取量为56.96 mg/g。研究相比之下减少了提取时间，降低了提取温度，与后者料液比相差1 倍，稀释后多酚提取量接近或超过，因此更符合日常多开饮茶习惯。

2.6 辣木茶溶液体外抗氧化活性

2.6.1 辣木茶清除DPPH 自由基能力

DPPH 是在含有自由基的化学反应中作为一种监测反应的物质，典型地用于实验室研究中抗氧化成分的体外抗氧化性评价。

辣木茶溶液与维C 溶液清除DPPH 自由基能力见图5。

图5 辣木茶溶液与维C 溶液清除DPPH 自由基能力

由图5 可知，质量浓度为1.25～20.00 mg/mL 时，辣木茶溶液具有很强的清除DPPH 自由基能力，清除率为94.10%～93.72%，质量浓度为1.25～10.00 mg/mL时，辣木茶溶液清除DPPH 自由基能力高于同浓度维C。

2.6.2 辣木茶对·O2-的清除能力

超氧阴离子（·O2-） 与羟基（-OH） 结合后的产物会导致细胞DNA 损坏，应用清除超氧阴离子（·O2-） 能力可评价抗氧化能力。

辣木茶溶液与维C 溶液清除·O2-能力见图6。

图6 辣木茶溶液与维C 溶液清除·O2-能力

由图6 可知，质量浓度1.25～20.00 mg/mL 范围内的辣木茶溶液具有一定的清除超氧阴离子能力，并随着质量浓度的增大而逐渐增高，20 mg/mL 时达到36.65%，相当于同浓度维C 溶液（91.16%） 的40.20%。

2.6.3 辣木茶总还原力

利用抗氧化剂将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾，亚铁氰化钾再利用三价铁形成普鲁士蓝，可由波长700 nm 处的吸光度变化来检测总还原力大小[21]。

辣木茶溶液与维C 溶液总还原力见图7。

图7 辣木茶溶液与维C 溶液总还原力

由图7 可知，在质量浓度0.2～1.0 mg/mL 范围内，辣木茶溶液和维C 溶液的吸光值随着质量浓度的增加而增大，说明其总还原力随着质量浓度的增大而逐渐升高。在质量浓度为0.2～0.6 mg/mL 时，辣木茶溶液和维C 溶液的吸光度很接近，在质量浓度1.0 mg/mL 时，辣木茶溶液的总还原力为0.579，维C溶液总还原力为1.241。

Sugahara S 等人[13]研究结果表明，辣木茶热水提取物具有较强的清除DPPH 自由基和超氧阴离子能力，并随着质量浓度的增大而逐渐增高，其EC50 分别为73.7 μg/mL 和246 μg/mL。Fombang E N 等 人[20]试验结果表明，在该优化提取条件下制备的辣木茶多酚对DPPH 自由基的清除率为81%，略高于抗坏血酸维C（77%），总还原能力为1.75 g 抗坏血酸当量/100 g。

3 结论

依据日常的饮茶习惯，选取了定比热水浸提的单因素试验和Box-behnken 响应面试验，优化辣木茶多酚提取工艺为料液比1∶42.12，提取时间为19.35 min，提取温度83.81 ℃，修正后的优化条件下多酚提取量为31.67±1.48 mg/g，所得回归模型应用性良好。测定辣木茶溶液的清除DPPH 自由基能力、清除超氧阴离子能力及其总还原力，证明了辣木茶具有一定的体外抗氧化活性，为开发辣木保健茶资源提供理论基础。辣木茶发酵过程中是否造成多酚的富集，以及辣木茶多酚是否为辣木茶体外抗氧化活性的主要贡献者等科学问题，还有待进一步验证。