万寿菊秸秆堆肥在缓解烟草连作障碍中的作用

黎妍妍　彭五星　张婷　孙玉晓　李锡宏

摘要：【目的】探索在大田試验条件下万寿菊秸秆堆肥对烟草连作根际土壤理化性状、微生物群落及烟草青枯病发生的影响，为利用万寿菊秸秆堆肥缓解烟草连作障碍提供依据。【方法】试验于2018—2020年进行，设2个处理：即施用1500 kg/ha万寿菊秸秆堆肥处理（FMC）和不施用万寿菊秸秆堆肥对照（CK）。施用万寿菊秸秆堆肥第3年（2020年），于烟叶移栽后50和100 d时采集烟株根际土壤，测定分析土壤理化指标和土壤细菌、真菌群落结构，并调查烟草青枯病发生情况。【结果】与CK相比，FMC处理的土壤pH和有机质含量显著提高（P<0.05，下同），而土壤碱解氮、有效磷和速效钾含量无显著变化（P>0.05）;FMC处理也可显著提高土壤细菌群落Sobs和Chao1指数，而对土壤真菌群落多样性的影响较小。施用万寿菊秸秆堆肥可改善土壤微生物群落结构，提升被孢霉属（Mortierella）、毛壳菌属（Chaetomium）等拮抗菌的相对丰度，而降低劳尔氏菌属（Ralstonia）和镰刀菌属（Fusarium）等病原菌的相对丰度。施用万寿菊秸秆堆肥3年可显著降低烟草青枯病的发病率和病情指数，对烟草青枯病的相对防效为47.72%。【结论】万寿菊秸秆堆肥可改善烟株根际土壤理化性状和微生物群落结构，降低烟草青枯病发病情况，在缓解烟草连作障碍方面具有积极作用。

关键词： 万寿菊;堆肥;烟草连作;理化性状;微生物群落

中图分类号： S572;S141.4                         文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）02-0451-09

Effects of marigold straw compost on alleviating continuous cropping obstacles of tobacco

LI Yan-yan PENG Wu-xing ZHANG Ting SUN Yu-xiao LI Xi-hong

（1Tobacco Research Institute of Hubei Province，Wuhan  430030， China; 2Xuanen Branch Company of Enshi Tobacco Corporation， Enshi， Hubei  445504， China; 3Hubei Tobacco Quality Supervision & Test Centre，

Wuhan  430030，China）

Abstract：【Objective】In order to alleviate the continuous cropping obstacles of tobacco， the effects of applying marigold straw compost on the physicochemical properties， rhizospheric microbial community and the occurrence of tobacco bacterial wilt were explored in field experiments. 【Method】The experiment was conducted from 2018 to 2020. Marigold straw compost was added each year either at 1500 kg/ha （FMC） or with 0 kg/ha as a control （CK）. In the third year of applying marigold straw compost （2020）， the samples of rhizosphere soil were collected at 50 and 100 days after tobacco transplanting. The soil physicochemical indexes， soil bacterial and fungal community structures and the occurrence of tobacco bacterial wilt were investigated. 【Result】Compared with CK， the application of FMC significantly increased soil pH and organic matter content （P<0.05，the same below）， while the contents of alkali-hydrolyzable nitrogen， available phosphorus and rapidly available potassium had no significant changes （P>0.05）. The application of  FMC could also significantly increase the Sobs and Chao1 indices of the soil bacterial community， but little effects on the diversity of the fungal community had been shown. The application of FMC also improved the microbial community structure and increased the relative abundance of some antagonistic fungi （such as Mortierella， Chaetomium）， while decreasing the relative abundance of some soil-borne pathogens （such as Ralstonia， Fusarium）. The application of FMC for three years significantly reduced the incidence and disease index of tobacco bacterial wilt， and the relative control effect on tobacco bacterial wilt was 47.72%. 【Conclusion】The application of FMC could improve the physicochemical properties and rhizospheric microbial community structure in the soil during tobacco cultivation， with a reduction in the incidence of tobacco bacterial wilt. The use of FMC effectively alleviates the obstacles to the continuous cropping of tobacco.

Key words： marigold; compost; continuous cropping of tobacco; physicochemical properties; microbial community

Foundation items：Major Programs of China National Tobacco Corporation[110201901042（LS-05）， 110202101047 （LS-07）]; Science and Technique Project of Hubei Tobacco Company， China National Tobacco Corporation （027Y2020-002）

0 引言

【研究意义】连作是一年内或连年在同一块田地上连续种植同一种作物的种植方式（侯慧等，2016）。由于耕地面积有限，连作在我国许多作物种植中较常见。烟草生产中也普遍存在连作现象（Chen et al.，2018;Bai et al.，2019;Li et al.，2020）。长期连作形成的连作障碍成为抑制烟草生长发育、降低烟草产质量、病害频发的主要因素（李世金等，2018）。在长期连作中，土壤生态环境和理化性状发生明显改变;反过来，土壤环境的恶化又会进一步加剧连作障碍（Chen et al.，2018;朱金峰等，2019;滕凯等，2020;Wang et al.，2020）。研究表明，作物秸秆堆肥在缓解连作障碍方面具有显著作用。因此，探讨秸秆堆肥在抑制烟草病害发生、减轻土壤环境恶化程度中的作用，对于缓解烟草连作障碍进而促进烟草产业发展具有重要意义。【前人研究进展】常见的适用于进行堆肥的作物秸秆主要有玉米秆、小麦秆、水稻秆等。施用玉米秸秆堆肥不仅可降低盐碱土的pH，显著提高土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾含量（赵英等，2012;王梦柯，2020）;还可增加根际土壤放线菌数量（黄继川等，2010），在激活玉米种植区域土壤酶活性、促进玉米根系发育方面具有重要作用（周杨等，2020）。施用麦秆和牲畜粪便发酵堆肥也可提高苹果连作土壤酶活性，增加土壤微生物数量，提高细菌和真菌的比值，使土壤微生物菌落结构向“细菌型”转化（张国栋等，2015）。猪粪—水稻秸秆堆肥提取液对番茄根系中线虫虫卵的抑制率达33.7%～87.9%，对土壤中线虫密度的抑制率达31.3%～51.4%（徐大兵，2011）。万寿菊作为一种具有抗菌性能的多用途作物（Gómez-Rodr??guez et al.， 2003），其秸秆中含有丰富的综纤维素（49.67%）和木质素（33.77%）（秦冲，2015）。因此，近年来万寿菊秸秆也逐渐被用于缓解作物连作障碍的研究中。万寿菊植物粉末作为生物熏蒸材料时，可显著提高土壤中养分含量及脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性，降低土壤中主要酚酸类化感物质含量，减轻其对根系的伤害（王晓芳等，2018，2019a）。在苹果连作土壤中添加万寿菊秸秆粉后，土壤细菌数量增加，土壤中尖孢镰孢菌基因拷贝数较不添加万寿菊秸秆粉的土壤降低18.6%～40.4%（王晓芳等，2019b）。在烟草上，黎妍妍等（2021）将万寿菊秸秆用作生物熏蒸材料施用于烟田后，土壤原核微生物群落多样性增加，土壤中拮抗菌、降解菌、功能菌和根际促生菌的相对丰度提升。【本研究切入点】目前，万寿菊的花是工业上提取分离叶黄素的理想原料。因此，关于万寿菊的应用多集中在花上，其秸秆常被随意抛弃或焚烧，造成资源浪费和环境污染。尽管万寿菊秸秆中含有丰富的综纤维素和木质素，是制作堆肥的较好来源，但目前关于万寿菊秸秆堆肥的研究鲜有报道，其在缓解作物连作障碍中的作用也未知。【拟解决的关键问题】探索在烟草连作条件下，万寿菊秸秆发酵堆肥对烟株根际土壤理化性状、微生物群落及烟草青枯病发生的影响，以期明确其在调理植烟土壤环境中的作用，旨在为缓解烟草连作障碍提供依据，并为合理利用万寿菊秸秆提供理论支撑。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用万寿菊秸秆来自于上年度在烟田周围播撒的试材。将万寿菊秸秆切碎或粉碎为3 cm左右的小段，均匀撒上秸杆腐熟剂和尿素的混合物，用薄膜封严，发酵100 d，制成万寿菊秸秆堆肥。所用秸杆腐熟剂由对秸杆具有迅速分解腐熟作用的放线菌、丝状真菌、酵母菌等菌株及相关酶类组成。堆肥中含有C 34.78%、N 0.50%、P 1.13%、K 0.35%。

试验种植烟草品种为云烟87。

1. 2 试验方法

试验于2018—2020年在湖北省恩施州宣恩县水井坳村进行。试验地烟草连作15年，土壤基础理化性状：pH 5.50、有机质2.42%、碱解氮141.32 mg/kg、有效磷56.80 mg/kg、速效钾460.52 mg/kg。试验设2个处理，即万寿菊秸秆堆肥处理（Fermentation of Marigold Compost，FMC）和常规对照（不施用万寿菊秸秆堆肥，CK），每处理3次重复，共6个小区，每小区种植100株，同一处理的3个重复交叉排列。根据前期研究（黎妍妍等，2021），确定FMC处理中万寿菊秸秆堆肥用量为1500 kg/ha。在FMC处理中，于基肥施用前2个月，均匀撒施1500 kg/ha万寿菊秸秆堆肥（施用前置于高温中灭菌）后，用旋耕机将秸秆堆肥与0～30 cm土层土壤进行均匀搅拌。烟草株距和行距分别为0.55 m和1.20 m，4月25日左右进行烟叶移栽，其他措施按当地烟叶生产技术规范进行栽培管理。

1. 3 烟草青枯病发生情况调查

烟叶移栽后50和100 d时，以株为单位，按照国家标准GB/T 23222—2008《烟草病蟲害分级及调查方法》记载各小区每株烟株青枯病发病严重度，计算发病率、病情指数和相对防效。

发病率（%）=（发病株数/总株数）×100

病情指数=100×[Σ（各级病株数×各级代表值）/调查总株数×最高级代表值]

相对防效（%）=（CK病情指数-处理病情指数）/CK病情指数×100

1. 4 土壤样品采集

施用万寿菊秸秆堆肥第3年（2020年），采用五点取样法分别于烟叶移栽后50 和100 d采集各小区烟株根际土壤样品，分别记作FMC50和FMC100、CK50和CK100。共计12个土样。

每个土样混匀后，剔除石粒和植物残茬等杂物。一部分样品在室温下风干，研磨并分别过筛，用于测定土壤理化性状;另一部分样品装入50 mL灭菌离心管中置于-80 ℃条件下保存，用于土壤DNA提取。

1. 5 土壤理化性状测定

土壤pH采用酸碱度玻璃电极法测定;土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾含量分别采用重铬酸钾—外加热法、碱解扩散法、碳酸氢钠—钼锑抗比色法和乙酸铵浸提—火焰光度计法测定。

1. 6 土壤微生物群落扩增子测序

土壤样品送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行DNA提取和扩增子测序。利用UPARSE对所有样品的Effective Tags进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成为OTUs。应用Mothur方法与SILVA的SSU rRNA数据库进行细菌物种注释分析，应用QIIME的Blast方法与Unit数据库进行真菌物种注释分析。

1. 7 统计分析

使用QIIME进行α多样性分析，计算Sobs、Chao1丰富度指数和Shannon多样性指数。用Students t-test分析土壤理化性状、微生物群落α多样性指数、不同分类水平上物种的相对丰度及烟草青枯病发生情况在FMC和CK间的差异。 前35个优势细菌属和真菌属的MetaStat分析由R软件生成。

2 结果与分析

2. 1 土壤理化性状分析

由表1可知，烟叶移栽后50和100 d，FMC处理的土壤pH和有机质含量均显著高于CK（P<0.05，下同）;其中，FMC50和FMC100的pH分別较对应CK提高0.38和0.28，有机质含量分别较对应CK提高11.44%和15.02%。而土壤碱解氮、有效磷和速效钾含量在处理间均无显著差异（P>0.05，下同）。

2. 2 土壤微生物群落多样性分析

2. 2. 1 土壤细菌群落α多样性分析 由土壤细菌群落α多样性的差异分析结果（表2）可知，烟叶移栽后50 d，FMC50处理的土壤细菌Sobs、Shannon和Chao 1指数分别较CK50提高19.37%、5.21%和24.31%，其中Sobs和Chao 1指数在处理间存在显著差异。烟叶移栽后100 d，FMC100处理的土壤细菌Sobs、Shannon和Chao 1指数较CK100分别提高41.87%、14.94%和83.74%，其中Sobs和Chao 1指数在处理间存在显著差异。以上结果表明施用万寿菊秸秆堆肥对土壤细菌群落的多样性和丰富度具有一定影响。

2. 2. 2 土壤真菌群落α多样性分析 由土壤真菌群落α多样性的差异分析结果（表2）可知，土壤真菌群落Sobs、Shannon和Chao 1指数在FMC50与CK50间、FMC100与CK100间均不存在显著差异，表明万寿菊秸秆堆肥对土壤真菌群落多样性影响较小。

2. 3 土壤微生物群落结构分析

2. 3. 1 土壤微生物群落门水平的组成分析 细菌16S rDNA高通量测序序列经物种注释后共获得87个门、149个纲、 300 个目、429个科和713个属类细菌。由图1-A可看出，在各处理根际土壤中，变形菌门（Proteobacteria，37.30%～54.66%）、unidentified_Bacteria（16.91%～24.26%）、酸杆菌门（Acidobacteriota，5.10%～9.63%）、绿弯菌门（Chloroflexi，2.68%～4.69%）、拟杆菌门（Bacteroidota，1.88%～3.26%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，1.62%～3.06%）、放线菌门（Actinobacteriota，1.45%～3.21%）、Myxococcota（1.27%～2.51%）、泉古菌门（Crenarchaeota，1.05%～1.65%）、蓝菌门（Cyanobacteria，0.05%～1.24%）为排名前10位的细菌门，共占84.22%～91.07%。在这些细菌门中，变形菌门、unidentified_Bacteria、酸杆菌门的相对丰度在各组中均高于5%，共占69.45%～77.82%。差异分析结果表明，CK50中变形菌门的相对丰度显著高于FMC50，unidentified_Bacteria的相对丰度显著低于FMC50;CK100中变形菌门的相对丰度显著高于FMC100，unidentified_Bacteria、Myxococcota的相对丰度显著低于FMC100。

ITS高通量测序序列经物种注释后共获得17个门、62个纲、 136个目、291个科和496个属类真菌。由图1-B可看出，在各处理根际土壤中，子囊菌门（Ascomycota，35.62%～61.15%）、担子菌门（Basidiomycota，2.15%～15.44%）、被孢霉门（Mortierellomycota，2.90%～14.30%）、壶菌门（Chytridiomycota，1.57%～10.05%）、罗兹菌门（Rozellomycota，0.05%～2.05%）、球囊菌门（Glomeromycota，0.10%～1.26%）、油壶菌门（Olpidiomycota，0.04%～1.12%）、毛霉菌门（Mucoromycota，0.10%～0.27%）、梳霉门（Kickxellomycota，0.01%～0.08%）、Aphelidiomycota（0.02%～0.04%）为排名前10位的真菌门，共占58.02%～81.29%。在这些真菌门中，子囊菌门、担子菌门、被孢霉门、壶菌门的相对丰度在各组中均高于1%，共占55.33%～78.37%。差异分析结果表明，10个真菌门的相对丰度在CK50与FMC50间无显著差异;子囊菌门在CK100中的相对丰度显著高于FMC100。

2. 3. 2 土壤微生物群落属水平的组成分析

2. 3. 2. 1 土壤细菌群落属水平的组成分析 在属水平上，FMC50、CK50、FMC100、CK100中相对丰度>1%的细菌属分别有10、11、9、12个，其中Chujaibacter、鞘鞍醇单胞菌属（Sphingomonas）、罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）、unidentified_Gemmatimonadaceae、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、Ellin6067和MND1的相对丰度在4组土壤中均>1%（图2-A）。

对排名前35位的细菌属进行MetaStat分析（图2-A）。烟叶移栽50 d时，FMC50中Candidatus_ Solibacter等4个菌属的相对丰度较高;CK50中鞘鞍醇单胞菌属等10个菌属的相对丰度较高。烟叶移栽100 d时，FMC100中Ellin6067等8个菌属的相对丰度较高;CK100中Candidatus_Nitrosotalea、劳尔氏菌属（Ralstonia）等13个菌属的相对丰度较高。总体来看，FMC50和FMC100属水平上的细菌群落结构较相似，聚为一类;CK50、CK100分别单独为一类。

差异分析结果表明（图2-A，表3和表4），FMC50中颗粒链菌属（Granulicella）的相对丰度显著高于CK50，是CK50的2.07倍;CK50中劳尔氏菌属、MND1和Escherichia-Shigella的相对丰度显著高于FMC50，分别是FMC50的1.88、2.01和4.60倍。FMC100中unidentified_Chloroplast和赭黄嗜盐囊菌属（Haliangium）的相对丰度显著高于CK100，分别是CK100的6.00和1.79倍;CK100中劳尔氏菌属和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia的相对丰度显著高于FMC100，分别是FMC100的5.71和2.01倍。

2. 3. 2. 2 土壤真菌群落属水平的组成分析 在属水平上，FMC50、CK50、FMC100、CK100中相对丰度>1%的真菌属分别有7、9、14、15个，其中微杆菌属（Microidium）、被孢霉属（Mortierella）、镰刀菌属（Fusa-rium）、Setophoma的相对丰度在4组土壤中均>1%。

对排名前35位的真菌属进行MetaStat分析（图2-B）。烟叶移栽50 d时，FMC50中微杆菌属、毛壳菌属（Chaetomium）等11个菌属的相对丰度较高;CK50中曲霉属（Aspergillus）等7个菌属的相对丰度较高。烟叶移栽100 d时，FMC100中Sagenomella等7个菌属的相对丰度较高;CK100中镰刀菌属等10个菌属的相对丰度较高。总体来看，FMC100和CK50属水平上的真菌群落结构较相似，聚为一类;CK100、FMC50分别单独为一类。

差异分析结果表明（图2-B、表3和表4），在前35位真菌属中，FMC50中毛壳菌属的相对丰度显著高于CK50，是CK50的2.56倍;CK50中镰刀菌属的相对丰度显著高于FMC50，是FMC50的1.75倍。FMC100中油壶菌属（Olpidium）、毛壳菌属、被孢霉属、Fusicolla的相对丰度显著高于CK100，分别是CK100的2.75、2.02、2.53和3.67倍;CK100中镰刀菌属和Rhizophydium的相对丰度显著高于FMC100，分别是FMC100的2.77和7.31倍。

2. 4 烟草青枯病发生情况

对烟草青枯病发生情况进行调查，结果（表5）显示，2018年烟草青枯病发病率和病情指数在FMC与CK间无显著差异。2019年，烟叶移栽后100 d，FMC处理烟草青枯病病情指数显著低于CK。2020年，FMC处理烟草青枯病发病率和病情指数均显著低于CK;至移栽后100 d时，FMC处理的相对防效为47.72%。由此可见，万寿菊秸秆堆肥对烟草青枯病的发生具有一定的防控作用。

3 讨论

土壤酸化和养分失衡是连作土壤退化的原因之一（滕凯等，2020;翁佩莹和郑红艳，2020）。有研究表明，发生连作障碍烟田的土壤pH和有机质含量均显著低于正常烟田的土壤（滕凯等，2020）。本研究结果显示，施用万寿菊秸秆堆肥可显著提高植烟土壤pH和有机质含量，与李增亮等（2019）、王晓芳等（2019a）利用万寿菊秸秆改良土壤环境的研究结果一致。万寿菊秸秆中含有丰富的综纤维素和木质素（秦冲，2015），施用堆肥后這些物质的分解矿化有利于提高土壤有机质含量，进而提高作物根系活力，促进作物生长（Wienhold et al.，2004）。同时，添加作物秸秆在提高土壤有机质含量的过程中也可降低土壤交换性酸和交换性Al3+，有效缓解土壤的酸化程度（兰丽丽等，2016）。

长期连作一般伴随着土壤微生物群落功能多样性的降低（王灿等，2017;肖蓉等，2020）。在土壤细菌、真菌等微生物群落中，细菌群落多样性通常被认为是维持生态系统平衡和恢复生态功能的重要因子（Avidano et al.，2005）。王桂君（2018）研究表明，在土壤中添加改良剂可增加土壤细菌群落的多样性。本研究中，万寿菊秸秆堆肥处理显著提高了土壤细菌群落Sobs和Chao1指数，而对土壤真菌群落多样性的影响较小，与上述研究结果基本一致，表明施用万寿菊秸秆堆肥有助于土壤微生物菌落结构向“细菌型”转化（张国栋等，2015）。

研究表明，连作不仅抑制土壤中有益微生物的生长，导致拮抗菌减少，还会造成病原微生物大量增加（Mendes et al.，2013;Gao et al.，2019;Liu et al.，2019;Liu et al.，2020;肖蓉等，2020）;而外源物的添加可改善土壤微生物群落结构（田小平等，2017;Yao et al.，2017a，2017b）。本研究中，万寿菊秸秆堆肥处理显著降低了土壤中变形菌门和子囊菌门的相对丰度。属水平上，万寿菊秸秆堆肥的土壤中被孢霉属、毛壳菌属的相对丰度是未施用堆肥土壤处理的2倍以上。据报道，被孢霉属具有降解芳烃等化感自毒物质的作用（Liu et al.，2019;Liu et al.，2020），毛壳菌属则可抑制多种土传病原菌的活性（孟庆果，2009），表明万寿菊秸秆堆肥可提升土壤中有益微生物和拮抗微生物的相对丰度。此外，万寿菊秸秆堆肥也可显著降低土壤中劳尔氏菌属和镰刀菌属等病原菌的相对丰度，这与王晓芳等（2018）采用万寿菊进行生物熏蒸降低土壤中病原菌的研究结果一致。

本课题组前期研究表明，1500 kg/ha万寿菊秸秆熏蒸烟田，对于缓解烟草连作障碍具有良好作用（黎妍妍等，2021）。本研究表明同等用量条件下万寿菊秸秆堆肥在改善土壤理化性状和微生物群落结构方面也具有明显作用。堆肥施用后，烟草青枯病的发生逐年减轻也是土壤理化性状改善、微生物群落结构平衡的正向反映。本研究不仅明确了万寿菊秸秆在缓解烟草连作障碍中的作用，而且为万寿菊的综合利用提供了思路，但关于万寿菊秸秆堆肥的优化及用量还有待于进一步研究。

4 结论

施用万寿菊秸秆堆肥可改善烟株根际土壤理化性状和土壤微生物群落，提高土壤pH和有机质含量，显著提升土壤细菌群落多样性和丰富度，增加拮抗菌的相对丰度而降低病原菌的相对丰度，进而抑制烟草青枯病的发生。万寿菊秸秆堆肥在改善连作烟田根际土壤环境和防控烟草青枯病发生方面具有积极作用。

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（責任编辑 王 晖）