pH/温度刺激响应型核-壳结构介孔二氧化硅纳米颗粒的设计与制备

2022-05-25陈昊文陈淼鑫刘晔宏张钰华徐首红

功能高分子学报 2022年2期

陈昊文，陈淼鑫，刘晔宏，张钰华，徐首红

（华东理工大学化学与分子工程学院，结构可控先进功能材料及其制备教育部重点实验室，上海 200237）

癌症是威胁人类健康的一大杀手，目前我国癌症防控形势严峻，防治难度巨大[1]。然而，传统的化学疗法治疗癌症的效果并不理想，现有抗癌药物在以较高剂量使用时往往具有较高的细胞毒性，引起显著的副作用[2-5]。这促使人们不断探索新型药物载体来克服传统化疗的缺点。到目前为止已经开发了多种药物载体，包括聚合物[6]、胶束[7]、脂质体[8]、树枝状大分子[9]、纳米颗粒[10]等。其中，介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）因具有较大的比表面积、良好的生物相容性、稳定的多孔结构以及表面易于修饰等特点而成为研究热点[11]。对MSNs表面进行修饰，不仅可以提高装载药物的效果[12,13]，同时还能利用肿瘤组织与正常组织微环境的不同之处，构建具有不同敏感响应型的载体，例如pH响应[14-16]、还原响应[17-18]、温度响应[19,20]、超声响应等[21,22]。Yang等[23]构建了一种pH敏感的多功能包膜型介孔二氧化硅，首先通过缩醛键将聚（N-丁二酰丙烯酸酯）涂覆在MSNs表面，然后将阿霉素（DOX）加载到MSNs孔道中，DOX在中性条件下表现出较低的药物释放，而在酸性条件下表现出有效的刺激响应型释放。此外，该研究中还引入了叶酸作为靶向成分，以实现肿瘤靶向能力；Cheng等[24]在MSNs表面修饰了细胞穿透肽，在对药物进行有效封装的同时，还增强了药物输送体系的细胞转染能力。尽管上述药物输送体系具有优良的靶向功能或细胞转染能力，但是这些功能分子在后续的研究中也暴露出了很多问题。比如，细胞穿透肽虽然能够协助载体更加快速地进入细胞，但是其本身并不具备选择性，即在进入肿瘤细胞的同时，也会进入正常细胞，从而引起强烈的副作用[25]。为了避免这些功能分子带来的不利影响，需要对其进行相应的保护，即在正常生理环境下对这些功能分子进行屏蔽，使之不会对正常细胞产生影响，但在肿瘤环境下能够暴露出来作用于肿瘤细胞。

甲基-2-丙烯酸-2-（2-甲氧基乙氧基）乙酯（MEO2MA）与聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯（OEGMA）的聚合物中含有大量醚氧键，在水溶液中可以与水分子间形成氢键，因此在其低临界溶解温度（LCST）以下呈亲水性，当环境温度高于其LCST时，氢键结构被破坏，聚合物由亲水性转变为疏水性，结构由舒展状态变为收缩状态。聚甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯（PDPA）是一种pH敏感聚合物，其侧链中含有的氮原子，在酸性环境中会发生质子化反应，从而导致聚合物由疏水性转变为亲水性。

本文通过溶胶凝胶法首先制备了MSNs；然后通过取代反应在MSNs表面引入溴原子制备了MSNs-Br，以便通过原子转移自由基聚合（ATRP）在MSNs表面修饰聚合物PDPA，合成MSNs-PDPA-Br；最后在PDPA链的尾端修饰了靶向分子叶酸（FA），制备了MSNs-PDPA-FA。

除此之外，利用ATRP反应制备了pH/温度双重响应型聚合物P（MEO2MAm-co-OEGMAn）-b-PDPAp。根据本课题组之前的研究[26]，聚合物的LCST可根据其单体物质的量之比进行调节。本文直接合成了所需LCST的聚合物P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10（下文简写为Polymer），并研究了其温度与pH响应特性。将P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10自组装在修饰了PDPA-FA的MSNs表面，构成核-壳结构自组装体系MSNs-PDPA-FA@Polymer，并用经过修饰的MSNs包载药物DOX（DOX@MSNs-PDPA-FA@Polymer）进行了体外模拟释药，研究了该载体的可控释药条件。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、氢氧化钠（NaOH）、正硅酸四乙酯（TEOS）、甲苯、三乙胺（TEA）、2-溴异丁酰溴（BiBB，w=98%）、四氢呋喃（THF）：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；五甲基二乙烯三胺（PMDETA,w=98%）、甲基丙烯酸二异丙胺基乙酯（DPA）、溴化亚铜（CuBr，w=98%）、FA（w=97%）、二甲基亚砜（DMSO）：分析纯，上海泰坦试剂有限公司；MEO2MA（w=97%）、OEGMA（w=97%，重均分子量为 475）、2-溴异丁酸乙酯（w=98%, EBiB）、二氯甲烷（DCM）、中性氧化铝（Al2O3, 110~200 μm）、正己烷（NHX）：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 测试与表征

核磁共振波谱（NMR）仪：瑞士布鲁克公司AVANCE Ⅲ 400 MHz型，测试温度25℃，溶剂CDCl3；动态光散射（DLS）仪：英国Malvern仪器公司Nano ZS型，样品均分散于超纯水中；紫外-可见分光光度计（UV-Vis）：日本岛津公司UV-2 450型；傅里叶红外光谱（FT-IR）仪：美国尼高力公司Nicolet 6 700型，KBr压片；高效凝胶渗透色谱（GPC）仪：英国Malvern仪器公司PL-GPC50型，THF作流动相；比表面积（BET）与孔径分析仪：美国Micromeritics仪器公司ASAP 2020型。

1.3 聚合物 P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10的合成

1.3.1 MSNs的合成将CTAB溶解于超纯水中，随后加入2 mol/L的NaOH溶液，搅拌并升温至80 ℃；在大力搅拌下向体系中匀速滴加TEOS，80 ℃继续反应2 h。用超纯水与乙醇交替洗涤以除去体系中的NaOH，60 ℃下真空干燥后置于马弗炉中煅烧除去CTAB模板，得到白色的MSNs。

1.3.2 MSNs-Br的合成将MSNs分散在甲苯中，在冰水浴避光搅拌下加入TEA和BiBB，并向体系中通入氮气以除去体系中的氧气，30 min后撤去冰水浴并移至30 ℃环境下避光反应24 h。用乙醇洗涤，真空干燥后得白色固体产物MSNs-Br。

1.3.3 MSNs-PDPA-Br的合成将MSNs-Br分散在超干THF中，加入配体PMDETA和单体DPA，重复液氮冷冻抽真空-解冻充氮气的过程，确保反应体系处于无水无氧状态，在氮气保护下加入催化剂CuBr。然后，将反应体系转移至恒温箱中，30 ℃继续反应24 h，用截留分子量为14 000的透析袋透析除去Cu2+，经冷冻干燥后得白色固体产物MSNs-PDPA-Br。

1.3.4 MSNs-PDPA-FA的合成将MSNs-PDPA-Br与FA分散溶解在DMSO中，加入几滴三乙胺调节溶液至碱性，通过排空气法向体系中通入氮气以除去氧气，80 ℃下反应12 h，用DMSO洗涤除去未反应的FA，常温下真空干燥得黄色固体产物MSNs-PDPA-FA。

1.3.5 pH/温度多重响应型聚合物P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10的合成[27]在反应茄瓶中加入单体MEO2MA与OEGMA、引发剂EBiB、配体PMDETA以及溶剂DCM。搅拌混合均匀后，进行“1.3.3”节中除水除氧的过程并在氮气保护下加入CuBr。然后将反应体系转移至恒温箱中，30 ℃反应12 h后，在氮气保护下将DPA转移至上述反应体系中，30 ℃继续反应12 h后，打开瓶塞以终止反应，以DCM为洗脱液，通过Al2O3层析柱除去反应体系中的催化剂CuBr2。最后旋蒸除去DCM，用-20 ℃的正己烷进行沉降，除去上层液体，室温下真空干燥得到无色透明的黏稠物质即为聚合物P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10。

1.4 MSNs-PDPA-FA@Polymer自组装体系的制备

首先，将MSNs-PDPA-FA均匀分散在磷酸盐缓冲液（PBS）中；然后，将聚合物P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10溶解在THF中并加入到MSNs-PDPA-FA的PBS中，敞口搅拌使THF挥发，在pH=7.4的环境下通过疏水作用制备MSNs-PDPA-FA@Polymer；最后将DOX与MSNs-PDPA-FA同时分散溶解在PBS中，待DOX进入MSNs的孔道之后，加入Polymer的THF溶液，继续搅拌12 h，制得包载有抗癌药物DOX的纳米颗粒DOX@MSNs-PDPA-FA@Polymer，该药物载体的制备示意图如图1所示。

图1 MSNs的聚合物修饰及其pH响应药物释放行为示意图Fig.1 Schematic diagram of polymer modification and the pH-responsive drug release behavior of MSNs

1.5 DOX@MSNs-PDPA-FA@Polymer的药物释放实验

载药纳米颗粒的药物释放行为示意图如图1所示。释药实验分为两组进行。第一组准备4份载有DOX的纳米颗粒，分别将其置于不同环境下；第二组准备1份载药纳米颗粒，将其置于pH=7.4、44 ℃的环境中，在释药8 h后将pH调节为5.0以检测药物的释放情况。通过紫外-可见分光光度计测量不同时间下DOX在485 nm处的吸光度值。其中，每个时刻下载药颗粒中释放的DOX紫外吸收强度与载药颗粒中包载的所有DOX的紫外吸收强度的比值即为该时刻下的累计释放量。

2 结果与讨论

2.1 MSNs-PDPA-FA的性能表征

样品的红外谱图如图2（a）所示，对于MSNs来说，1 080、941、802 cm−1处出现的特征峰归属于Si-O键伸缩振动、Si-OH键以及Si-O-Si键的弯曲振动。在修饰了Br原子以及PDPA后，在694 cm−1处出现了C-Br键的伸缩振动峰；在1 550、1 240 cm−1处出现了PDPA的特征峰，这归属于C=O键和C-O-C键的伸缩振动。在接枝FA后，694 cm−1处归属于C-Br键的特征峰消失，表明MSNs-PDPA-Br上的Br原子已被取代，并且在3 420 cm−1处出现了FA中氨基的特征峰，这归属于伯胺中N-H键的伸缩振动，而PDPA链中的N原子为叔氮，不会产生N-H键的振动，证明PDPA和FA被有效修饰到MSNs表面。

图2 样品的（a）红外光谱图和（b） Zeta 电位图Fig.2 （a） FT-IR spectra and （b） Zeta potential of samples

如图2（b）所示，样品的表面电位随着MSNs表面的逐步功能化而改变，MSNs、MSNs-Br、MSNs-PDPA-Br、MSNs-PDPA-FA在pH=7.4下的表面电位分别为-22.3、-3.9、-16.6、-4.9 mV，在接枝FA分子后，MSNs的表面电位转变为接近电中性，这可以认为是FA分子表面带有的正电荷中和了MSNs-PDPA-Br上的负电荷，印证了官能团或功能分子被连续修饰到MSNs表面。PDPA在酸性环境中容易与H+发生质子化反应，由疏水的收缩结构转变为亲水的伸展结构，如图2（b）所示，将溶液pH调节为5.0后，MSNs-PDPA-FA的表面电位发生电荷反转，由-4.9 mV转变为21.0 mV。

除此之外，还可通过其粒径变化测定MSNs-PDPA-FA的pH敏感点（图3（a））。当溶液的pH为3.0～5.5时，PDPA为伸展状态，粒径较大，保持在250 nm左右；将溶液的pH调至6.0以上时，PDPA结构收缩，粒子的粒径减小，最终在pH=7.4时减至211 nm左右。不同pH下的粒径变化曲线如图3（b）所示，当pH=5.5～6.0时粒径发生突变，故MSNs-PDPA-FA的pH敏感点位于这个区间。肿瘤外部环境的pH＞6.5，因此该载体可以避免药物在肿瘤外部环境下的过早释放，实现药物的有效控释。

图3 MSNs-PDPA-FA在不同pH下的（a）粒径分布曲线和（b）平均粒径Fig.3 （a） Particle size distribution and （b） average particle size of MSNs-PDPA-FA at different pH values

2.2 P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10的结构和性能表征

壳层聚合物P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10的1H-NMR谱图如图4所示。化学位移在0.6～1.2处出现的峰代表聚合物主链上的-CH3特征峰，1.6～2.1处代表主链上的-C-CH2-特征峰，3.4处代表侧链末端的-O-CH3-特征峰，3.5～3.8处出现与醚氧键相连的亚甲基上的氢特征峰，在2.7以及3.0处出现了与二异丙胺基相连的亚甲基（-N-CH2-）特征峰以及异丙基上的氢特征峰，说明通过ATRP反应成功合成了聚合物 P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10。

图4 P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10在 CDCl3中的1H-NMR谱图Fig.4 1H-NMR spectrum of P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10 in CDCl3

聚合物水溶液的透光率随温度变化的结果如图5（a）所示。随着温度的升高，聚合物溶液的透光率发生了明显变化，在较低温度时，透光率接近100%；当温度升高时，聚合物中的醚氧键与水分子之间形成的氢键因高温而断裂，聚合物因此由亲水转变为疏水，其水溶液由澄清变为浑浊，透光率在44 ℃时由97%迅速降低至1%，接近于0。

在25 ℃下，该聚合物的透光率随pH变化的结果如图5（b）所示。首先将聚合物水溶液调节至pH=3，滴加NaOH溶液使pH按照0.5或1个pH单位梯度升高。当溶液在较低的pH时，聚合物为亲水结构，故溶液澄清透明；将溶液的pH调至6.0以上时，PDPA发生去质子化反应，溶液的透光率急剧降低。由图5可知，该聚合物的LCST为44 ℃，pH敏感点位于6.0附近。

图5 P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10 水溶液透光率与（a）温度和（b） pH 的变化关系Fig.5 Transmittance of P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10 solution as a function of （a） temperature and （b） pH value

2.3 MSNs-PDPA-FA@Polymer自组装体系的表征

2.3.1 MSNs-PDPA-FA@Polymer的表征图6（a）分别为MSNs、MSNs-PDPA-FA 以及MSNs-PDPA-FA@Polymer的TEM图，可以看到MSNs具有清晰规则的孔道结构，在组装聚合物后，孔道结构消失，并且还能看到MSNs-PDPA-FA@Polymer的核-壳结构。从粒径分布上（图6（b））可以观察到，随着聚合物的修饰，其粒径逐渐由170 nm增至240 nm；MSNs的比表面积为1 133 m2/g，而在修饰PDPA-FA后，其比表面积下降到505 m2/g，在聚合物自组装后，比表面积进一步下降到490 m2/g（图6（c）），其孔径也由2.46 nm降至2 nm以下（图6（d）），证明聚合物的修饰能够很好地覆盖MSNs的孔道。以上结果均证明了聚合物P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10能够被自组装到MSNs-PDPA-FA表面。

图6 样品的（a）TEM 图；（b）DLS 粒径分布；（c） N2 吸附-脱附曲线；（d）孔径分布曲线Fig.6 （a） TEM images; （b） DLS size distribution; （c） nitrogen absorption-desorption isotherms and （d） pore size distributions of samples

样品热重分析结果（图7）也显示，从30 ℃升温到900 ℃的过程中，样品的失重率不断增大，900 ℃时MSNs的失重率为3.82%，可以归因于其表面吸附的水分蒸发；MSNs-PDPA-Br、MSNs-PDPA-FA和MSNs-PDPA-FA@Polymer的失重率分别达到了24.52%、29.14%和33.70%，通过分析可以大致估算出，自组装到MSNs表面的FA含量为46.2 mg/g，温敏聚合物的含量约为45.6 mg/g。以上种种分析均证明了聚合物P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10能够被自组装到MSNs-PDPA-FA表面。

图7 样品的热重分析曲线Fig.7 TGA curves of samples

2.3.2 MSNs-PDPA-FA@Polymer的温度响应性将MSNs-PDPA-FA@Polymer分散于超纯水中，其粒径随温度的变化如图8所示。当温度在聚合物P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10的LCST以下时，整个自组装体系的粒径相对变化不大，维持在240 nm左右；当环境温度为44～48 ℃时，粒径急速降低至215 nm左右；当温度提高至聚合物的LCST以上时，其粒径与自组装前的MSNs-PDPA-FA颗粒相似。由此得出，修饰到MSNs表面的聚合物P（MEO2MA90-co-OEGMA10）-b-PDPA10，在温度上升到其LCST以上时，由于疏水作用会发生大幅度的收缩，有望将MSNs上的功能分子FA暴露出来，使其起到靶向作用。

图8 MSNs-PDPA-FA@Polymer的粒径与温度的关系Fig.8 Size of MSNs-PDPA-FA@Polymer as a function of temperature

2.3.3 MSNs-PDPA-FA@Polymer的pH响应性室温下将MSNs-PDPA-FA@Polymer分散于超纯水中，其Zeta电位随pH的变化如图9所示。在将样品的pH由7.4调节为5.0后，自组装体系的Zeta电位发生了反转，由pH=7.4下的-11.7 mV反转到20.6 mV，该电位与图2（b）中pH=5.0下MSNs-PDPA-FA的电位相一致，证明了当pH=5.0时，该自组装结构发生了解离，导致FA分子重新暴露在MSNs表面。虽然在酸性环境下，壳层的聚合物从MSNs表面脱落，但接枝在MSNs表面的PDPA-FA聚合物链此时因发生了质子化而变得亲水，处于伸展状态。当pH=5.0时，MSNs-PDPA-FA的粒径为247.9 nm，而壳层聚合物未脱落时的粒径为240 nm，因此降低pH所测得的粒径并未发生较大改变。

图9 25 ℃下 MSNs-PDPA-FA@Polymer的Zeta电位与 pH的关系Fig.9 Zeta potential of MSNs-PDPA-FA@Polymer as a function of pH values at 25 ℃

2.4 MSNs-PDPA-FA@Polymer在不同环境下的药物释放

DOX的连续累计释放曲线如图10（a）所示，在pH=7.4、37 ℃下，48 h累计释放量只有10%；将温度升高至44 ℃，48 h累计释放量也仅仅增加到了20%；在pH=5.0、37 ℃下，DOX的48 h累计释放量可达50%；然而当同时改变温度和pH时，DOX的48 h累计释放量达到了65%。44 ℃时DOX的pH分阶段释放曲线如图10（b）所示，当pH=7.4时，药物前8 h的累计释放量只有8%；将环境的pH调节为5.0，此时PDPA迅速转变为亲水性，结构舒展，MSNs的孔道得以打开，药物从中释放，因此在8 h处出现了一个极明显的转折点，最终在50 h处释放量达到了65%。实验证明，该载体能够实现较好的药物封装效果，并且可以灵敏地响应周围环境变化，实现药物的可控释放。

图10 MSNs-PDPA-FA@Polymer的（a）释药动力学曲线和（b）多阶段pH响应释药曲线（44 ℃）Fig.10 （a） Drug release kinetics curves and （b） the programmable drug release curves of MSNs-PDPA-FA@Polymer at 44 ℃