氧化石墨烯改性形状记忆纤维的片层尺寸相关性

2022-05-25薛苏桐王先流易兵成郭煦然沈炎冰张彦中

功能高分子学报 2022年2期

薛苏桐，王先流，易兵成，郭煦然，唐寒，沈炎冰，张彦中

（东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620）

在全球范围内，每年有成千上万的患者因创伤、疾病、衰老等原因造成骨缺损，这在很大程度上影响了患者的健康和生活质量。骨组织工程（BTE）技术可为解决临床上传统骨缺损治疗方法中存在的各种不足提供最有潜力的解决方案。BTE的基本方法是将生物材料支架作为细胞和信号因子的载体来诱导成骨，或植入后从周围骨组织募集细胞并使其原位生长和分化，最终形成新骨。由于骨组织是承力组织，力学刺激对细胞的成骨诱导分化起着重要作用[1]，因此，在BTE生物材料支架的设计中，如果能使其具有合理施加力学刺激的功能，将为加速骨缺损修复和增强再生功效提供新的思路。

热响应类形状记忆聚合物（SMPs）可通过形状改变有效调节自身力学性能并实现微创植入，为发展力学活性BTE支架提供了新的材料选择[2]。基于SMPs的BTE支架在回复过程中若与周围骨组织接触，就会对骨细胞施加力学刺激并通过力学转导机制调控细胞的成骨行为[3]，但SMPs通常存在生物活性不佳、力学性能不足等问题[4]，因此需要通过不同的方式（如采用无机纳米填料[5]）对其进行有效增强改性。

氧化石墨烯（GO）作为一种二维纳米光热转换材料[6]，不仅杨氏模量高、易于表面功能化，而且可促进细胞黏附和增殖[7]。近年来，已有研究将GO用于增强聚合物的力学性能[8]、形状记忆性能[9]和生物功能[10]。如Liu等[11]证明乳酸-己内酯共聚物（PLCL）形状记忆纤维在负载0.5%（质量分数，下同）的GO后，可使拉伸杨氏模量提高28.4%，形状回复应力提高28.3%；将骨髓间充质干细胞（BMSCs）接种在GO/PLCL纤维支架上培养14 d后，其成骨标志物的分泌量也明显提高。Huang等[12]将GO与四臂聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物（4A-PEG-PCL）纤维支架进行光交联后，不仅改善了支架的力学性能和形状记忆性能，还促进了小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）成骨相关基因的表达。这些研究表明在SMPs中引入GO能有效增强其力学性能及成骨诱导性能，但GO纳米片层尺寸对力学增强效果、形状记忆性能和成骨诱导性能的影响尚鲜见报道。

本课题组前期已证明左旋聚乳酸（PLLA）/聚（3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯）（PHBV）（PLLA/PHBV）复合纤维膜具有良好的形状记忆性能和生物相容性[13]。在此工作基础上，本文首先对不同片层大小GO的化学结构和片层尺寸进行表征，然后通过电纺方法将不同片层尺寸的GO负载到PLLA/PHBV超细纤维中形成GO@PLLA/PHBV复合纤维膜，并对所制备的复合纤维膜的形貌、组成、热性能、力学性能及形状记忆性能进行系统的表征，最后通过体外细胞实验评估细胞相容性和成骨诱导性能。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

GO：上海理工大学提供，依据其片层尺寸的小、中、大依次命名为sGO、mGO和1GO；PLLA：Mw=1.0×105，济南岱罡生物材料有限公司；PHBV：Mw=5.2×105，宁波天安生物材料有限公司；六氟异丙醇（HFIP）：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司。

1.2 GO的表征

采用拉曼光谱仪（Raman，美国Thermo Fisher Scientific公司DXR2xi型）对GO的化学结构进行表征，选择He-Ne激光发射器，发射功率为17 mW、波长为633 nm。

采用场发射扫描电镜（FESEM，日本日立公司S-4800型）对分散于HFIP中、经1 h超声处理的不同片层尺寸的GO进行形貌观察和拍照，操作电压为5 kV，倍数为4 000倍。通过ImageJ软件测量FESEM图片中的GO片层面积。

1.3 GO@PLLA/PHBV复合纤维膜的制备与结构表征

常温下，首先将不同片层尺寸GO加入HFIP中超声（冰浴）1 h；接着在70 °C下加入PHBV，搅拌约15 min使其分散，再加入PLLA 搅拌过夜形成 GO@PLLA/PHBV 纺丝液（m（PLLA）/m（PHBV）=7∶3，m（GO）/m（PLLA/PHBV）=1%，m（GO@PLLA/PHBV）/V（HFIP）=0.08 g/mL）；然后通过电纺丝方法将纺丝液制备成复合纤维膜，纺丝参数如下：电压为13 kV，接收距离为15 cm，注射速率为0.8 mL/h，湿度为50%～70%，室温；最后将所制备的复合纤维膜放入真空干燥箱中干燥72 h以上备用。

采用FESEM和透射电子显微镜（TEM，日本电子株式会社JEM-2100型）观察复合纤维膜的形貌，并用ImageJ软件测量纤维直径；用拉曼光谱仪对复合纤维膜进行结构表征；用热重（TG）分析仪（德国NETZSCH公司TG209 F1型）对复合纤维膜进行GO含量分析，氮气保护，升温速率为10 °C/min；用X射线衍射（XRD）仪（日本理学株式会社SAXSessmc2型）对复合纤维膜进行结晶度分析，管电压为40 kV，管电流为200 mA，扫描速率为 3（°）/min，扫描范围为 5°～60°，Cu 靶；用差示扫描量热（DSC）仪（德国 NETZSCH 公司 DSC-822 型）确定复合纤维膜的玻璃化转变温度（Tg），氮气保护，气流速率设定为20 mL/min，升温速率设定为10 °C/min，温度范围为 0 ～ 120 °C。

1.4 GO@PLLA/PHBV复合纤维膜的力学性能和形状记忆性能

通过动态热机械分析（DMA）仪（美国TA仪器公司Q800型）在26 °C下测试复合纤维膜的拉伸性能与形状记忆性能。首先将纤维膜在47 °C热平衡2 min；接着以0.2 MPa/min的拉伸速率将应力从0提高到2.0 MPa（变形阶段）；然后以 5 °C/min 的降温速率冷却至 0 °C，将应力卸载至 0（固定阶段）；最后以 5 °C/min 的升温速率将温度升至47 °C诱发形状回复（回复阶段）。重复上述过程3次并记录数据。形状回复率（Rr）和形状固定率（Rf）分别按公式（1）和公式（2）确定：

其中，εDeform是变形和冷却过程中的最大应变，εFinal是加热后的回复应变，εBegin是初始应变，εFix是0 °C下的固定应变。

为检测形状回复应力，首先将尺寸为50 mm × 10 mm × 0.07 mm的纤维膜样品（样品数n≥ 3）置于47 °C的水浴中拉伸100%后迅速转移至0 °C冰浴中进行塑形固定，然后将塑形后的纤维膜样品夹持在自制的形状回复应力测试装置上，在47 °C的水浴中检测纤维膜的形状回复应力[14]。

为了解各复合纤维膜中引入GO后带来的热响应敏感性，用808 nm激光器在1.3 W/cm2的光强下照射纤维膜样品（50 mm × 20 mm × 0.07 mm，n≥ 3）55 s，通过红外热像仪测温并绘制温度-时间关系曲线，获得升温速率。

1.5 GO@PLLA/PHBV复合纤维膜的成骨诱导性能

按每孔1 × 104个的细胞密度将BMSCs分别种植在各复合纤维膜上；在特定时间点（1、3、6 d）吸去培养基后，加入磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次；避光条件下加入300 μL含CCK-8试剂(Cell Counting Kit-8 细胞计数试剂)的培养基，在细胞培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司HF90型）中培养3 h；每孔取100 μL加入到96孔板中，用酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司MK3型）检测450 nm处的吸光度（OD）。

通过细胞骨架和细胞核染色了解细胞的铺展情况，步骤为：将细胞按每孔3 × 104个的细胞密度分别种植在各复合纤维膜上，培养3 d后吸去培养基，加入PBS清洗3次；每孔加入200 μL多聚甲醛固定液固定20～30 min，用PBS清洗3次；每孔加入400 μL聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）通透10 min后吸除，PBS清洗3 次；避光将罗丹明-鬼笔环肽（5 μg/mL）按每孔 400 μL 加入，30 min 后吸除，PBS 清洗 3 次；然后将 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1 μg/mL）按每孔 400 μL 加入，15 min后吸除，PBS 清洗 3 次；最后用荧光显微镜（日本Nikon公司Nikon 80i型）观察并拍照。

成骨分化：将细胞按每孔3 × 104个的细胞密度分别种植在各复合纤维膜上，培养14 d后进行碱性磷酸酶（ALP）染色和定量检测。ALP染色步骤为：吸去多余培养基后用PBS清洗3次；每孔加入200 μL多聚甲醛固定液固定20 ～ 30 min，之后用PBS清洗3次；参照ALP显色试剂盒配制染色工作液，每孔加入200 μL工作液并在室温下避光孵育20 min后用去离子水清洗3次；将染色后的纤维膜置于载玻片上在倒置荧光显微镜上观察染色结果并拍照。ALP定量步骤为：吸去培养基，用Triton X-100裂解液将细胞裂解30 min，之后在1 000 r/min下将裂解液离心5 min；取30 μL上清液加入96孔板中，参照ALP测定试剂盒的说明，每孔加入50 μL反应液后，在37 °C水浴中温热处理15 min；最后加入150 μL显色剂，用酶标仪检测520 nm处的OD值。

钙沉积：将BMSCs按每孔3 × 104个的细胞密度分别种植在各复合纤维膜上，培养14 d后进行茜素红（ARS）染色和定量检测，从而对BMSCs的钙沉积进行分析。ARS染色步骤为：吸去多余培养基后用PBS清洗3次，加入异丙醇溶液（体积分数为60%）将细胞固定2 min后，用PBS清洗3次；加入200 μL ARS染色液染色20 min直至孔板内出现橘红色，之后用去离子水清洗至无色后在倒置荧光显微镜上观察钙沉积情况。ARS定量步骤为：在每孔中加入500 μL氯化十六烷基吡啶溶液（体积分数为10%）孵育30 min后将染料洗脱，取200 μL洗脱液转移至96孔板中，用酶标仪检测570 nm处的OD值。

1.6 统计学分析

采用Origin 8.0对数据进行单因素方差分析，以评价样品之间是否存在显著性差异（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。

2 结果与讨论

2.1 GO的片层尺寸表征

用拉曼光谱仪对GO的化学结构（图1（a））进行表征，拉曼光谱如图1（b）所示。从图1（b）可以看出，在1 349 cm−1和1 598 cm−1处分别出现石墨烯类二维纳米片结构典型的特征D峰和G峰[15]，且这些特征峰的谱带强度也表现出对GO片层尺寸的依赖性，但sGO、mGO和lGO的拉曼图谱中，D峰与G峰的强度比值（ID/IG）较接近，分别为0.64、0.70和0.69，表明不同片层尺寸GO的氧化程度相似[16]。

通过FESEM对超声前后不同片层尺寸GO进行形貌观察（图1（c））。超声分散处理可使不同尺寸GO获得较好分散，但各GO的片层尺寸均有显著减小，sGO、mGO、lGO的片层尺寸分别由超声处理前的（3.3 ±3.8）μm2、（6.7 ± 3.9）μm2、（29.1 ± 25.0）μm2减小至（1.9 ± 2.1）μm2、（5.4 ± 3.6）μm2、（21.3 ± 16.5）μm2。值得注意的是，虽然超声作用可使sGO、mGO及lGO的横向尺寸减小，但各GO在超声处理后依旧保持小、中、大3种尺寸的差异性。

图1 GO 的（a）化学结构，（b）Raman 光谱图及（c）FESEM 形貌图Fig.1 （a） Chemical structure,（b） Raman spectra and （c） FESEM images of GO

2.2 GO@PLLA/PHBV复合纤维膜的形貌与结构

复合纤维膜的FESEM形貌观察如图2（a）所示，各组纤维取向随机、表面光滑、无明显串珠等缺陷，PLLA/PHBV、sGO@PLLA/PHBV、mGO@PLLA/PHBV及 lGO@PLLA/PHBV的直径分别为（1.25 ± 0.31）μm、（0.92 ± 0.26）μm、（1.29 ± 0.31）μm 及（1.05 ± 0.21）μm。有少量的 sGO 和 mGO“镶嵌”在纤维膜表面或内部，而 lGO因片层尺寸较大将纤维“包裹”起来，这些结果与通过TEM观察到的GO在纤维膜上的形式一致（图2（b））。

图2 复合纤维膜的（a）FESEM和（b）TEM形貌图（白色箭头所指为GO）Fig.2 （a） FESEM and （b） TEM images of fibrous composite membranes （The white arrows point to GO）

从复合纤维膜的拉曼光谱分析结果（图3（a））可知，PLLA/PHBV在2 937 cm−1和3 000 cm−1处的特征峰比较明显[16]，而负载GO后，从mGO@PLLA/PHBV和lGO@PLLA/PHBV的拉曼谱图上可观察到GO的sp3杂化相对应的D峰（1 349 cm−1处）和sp2碳原子平面振动相对应的G峰（1 584 cm−1处）[15]，但由于拉曼光谱强度对GO片层尺寸的依赖性，GO的D峰和G峰在sGO@PLLA/PHBV复合纤维膜的拉曼谱图中不易观察到（放大后可见）。热重分析结果显示，不同纤维膜中所负载GO的质量分数约1%（图3（b））。

图3 复合纤维膜的（a）拉曼光谱图、（b）热失重曲线、（c）XRD 图谱和（d）DSC 图谱Fig.3 （a） Raman spectra, （b） TG curves, （c） XRD patterns and （d） DSC curves of the fibrous composite membranes

从复合纤维膜的 XRD图谱（图3（c））可知，GO的掺入可使 PLLA/PHBV的结晶度显著降低，sGO@PLLA/PHBV、mGO@PLLA/PHBV、lGO@PLLA/PHBV的结晶度从最初的57.24%分别降低至15.61%、16.59%及20.41%，尤以sGO对PLLA/PHBV结晶性的影响最为明显。这可能是由于在聚合物凝聚态下，均匀分散的GO导致分子链运动速率降低[17]，阻碍结晶作用增强。虽然掺入GO使聚合物结晶的活化能降低会有利于聚合物的结晶，但邻近的GO会阻碍聚合物微晶的生长，导致结晶度降低[9]。

从复合纤维膜的DSC图谱（图3（d））可知，在PLLA/PHBV中掺入不同尺寸的GO后，Tg略有降低，以引入sGO的复合纤维膜下降最大。这是因为相同质量分数下，尺寸越小的GO越易于分散和导热，在较低的温度下就能实现相转变，导致PLLA/PHBV的Tg降低[9]。较低的Tg可以降低SMPs支架因回复温度过高带来的细胞损伤风险[18]。

2.3 GO@PLLA/PHBV复合纤维膜的力学性能和形状记忆性能

复合纤维膜的拉伸杨氏模量结果（图4（a））显示，相比于 PLLA/PHBV 的杨氏模量（24.0 ± 0.3）MPa，当掺入 sGO、mGO 和 lGO 后，对应纤维膜的杨氏模量分别提高至（53.8 ± 5.9）MPa、（41.9 ± 6.4）MPa和（30.6 ± 4.2）MPa。这是因为GO尺寸越小，范德华相互作用和π-π共轭越弱，更容易在基体中均匀分散，有利于纤维力学性能的提高[19]。

复合纤维膜的形状固定率和形状回复率结果（图4（b））表明，PLLA/PHBV的Rf为96%左右，而当掺杂sGO后Rf显著提高至98%以上，这可能是因为掺杂sGO的复合纤维膜具有更高的储能模量，即更多的可被“冻结”的软链，因此具有更高的Rf[20]。从Rr结果看，PLLA/PHBV复合纤维膜与掺杂有mGO、lGO的复合纤维膜的Rr均为50% ～ 80%，而当掺杂sGO后Rr可提高至100%左右，这与GO尺寸较小易于在基体中分散有关[19]，分散性良好的GO可提高聚合物的导热性能和储能模量，有助于提高形状回复率[9,21]。

图4 复合纤维膜的（a）拉伸杨氏模量、（b）形状固定率和形状回复率、（c）最大回复应力和（d）升温速率Fig.4 （a）Tensile Young＇s modulus,（b） shape fixation rate and shape recovery rate,（c） ultimate recovery stress and （d）the heating rates of fibrous composite membranes

从复合纤维膜形状回复应力的测试结果（图4（c））可以看出，掺入GO后，可使复合纤维膜的最大回复应力升高，且掺入GO的尺寸越小，对分子链的限制越强，储能模量增加，聚合物的形状回复应力越高[22]。

从复合纤维膜的温度敏感性结果（图4（d））可以看出，在同样的光照条件下，掺杂有sGO的复合纤维膜具有最快的升温速率，意味着高的热响应敏感度，这是因为sGO分散性好，可使聚合物基体的受热更均匀，受热范围更广[23]，这一结果对外源光热刺激响应的形状记忆材料的应用具有重要意义[24]。

2.4 GO@PLLA/PHBV复合纤维膜的成骨诱导性能

细胞增殖结果如图5（a）所示，在培养3 d和6 d后，mGO@PLLA/PHBV和lGO@PLLA/PHBV上的细胞数量明显多于PLLA/PHBV和sGO@PLLA/PHBV的细胞数量（*p＜ 0.05），说明掺杂较大尺寸GO更有利于细胞增殖。这与mGO、lGO在纤维表面的分布状态有关，更多的黏附位点有利于细胞增殖[16,25]。

通过细胞骨架染色（图5（b））可揭示与细胞形态有关的细胞内超微结构，相比于PLLA/PHBV和sGO@PLLA/PHBV，BMSCs在mGO@PLLA/PHBV和lGO@PLLA/PHBV上的铺展面积更大，尤以在lGO掺杂的复合纤维膜上的铺展面积最大。这可能是因为曝露在纤维表面的lGO可为细胞提供更多的黏附位点，有利于细胞的铺展[16]。

ALP检测结果（图5（c））表明，与 PLLA/PHBV相比，BMSCs在 sGO@PLLA/PHBV、mGO@PLLA/PHBV及lGO@PLLA/PHBV上的ALP分泌量分别提高了36%、57%和92%（图5（d）），其中以掺杂有lGO的复合纤维膜的促进作用最为明显。

图5 BMSCs在复合纤维膜上（a）培养 1、3、6 d的增殖情况；（b）培养 3 d的骨架染色图；培养 14 d后（c）ALP 和 ARS的染色图及（d）定量测定结果Fig.5 （a） Proliferation assayed at 1, 3, 6 d;（b） Images of cytoskeleton staining at 3 d;（c） ALP and ARS staining and （d） quantitative measurements for 14 d of BMSCs cultured on the fibrous composite membranes

ARS检测结果显示（图5（c）），与 PLLA/PHBV 相比，BMSCs在 sGO@PLLA/PHBV、mGO@PLLA/PHBV及lGO@PLLA/PHBV上的钙沉积分别增加了70%、75%和133%（图5（d）），同样，掺杂有lGO的复合纤维膜的促钙沉积作用最显著，这一结果与ALP染色结果相一致。

以上结果说明，PLLA/PHBV复合纤维中引入lGO后可形成的黏附位点更多，从而显著促进PLLA/PHBV对BMSCs的成骨分化诱导作用[25,26]。