超高效液相色谱-串联质谱法同时分析铁皮石斛茎部鲜样中的酚酸类物质的技术及应用

黄 彪 吴建鸿

（1.福建省农产品质量安全重点实验室,福建 福州 350003；2.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,福建 福州 350003）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属草本植物，是我国传统的中草药，具有很高的药用价值和经济价值，在我国许多区域如广东、福建、海南、浙江等地都有野生资源及人工栽培。铁皮石斛的利用一般是将其茎部位烘干后加工成石斛枫斗、胶囊、石斛粉以供药（食）用，也有将其新鲜茎部压榨调配成饮品进行食用。现代药理研究表明，铁皮石斛具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫等作用[1-3]。铁皮石斛中的活性成分包括多糖[4]、生物碱[5]、联苄衍生物[6]、氨基酸[7]、菲[8]、类黄酮[9]、酚酸[10]等。酚酸是一类分子结构中含酚羟基与羧基的多酚类化合物，作为植物的次级代谢产物，在植物组织中广泛存在，对植物的生理活动有着重要的影响。相关研究表明，酚酸类化合物具有良好的抗氧化、防癌抗癌、杀菌、抗炎等功效[11]。目前有关铁皮石斛中酚酸类物质的研究报道较少[22]，因而研究分析铁皮石斛中酚酸类物质的组成和含量具有重要的意义。

目前报道的检测方法主要有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）[11]、高分辨质谱法（high resolution mass spectrometry,HRMS）[12]及高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS）[13-14]。相对于HPLC，HPLC-MS/MS的选择性更好，灵敏度更高，抗干扰能力更强，检测更迅速，其在农产品质量安全检测、环境污染物监测、功能性食品活性成分的分析鉴定等方面发挥着越来越重要的作用。

随着人们对养生健康日益重视，鉴于铁皮石斛重要的药用价值和保健价值，铁皮石斛多样性产品也被不断开发出（如铁皮石斛鲜条、铁皮石斛花、铁皮石斛酒等），食用方法也多样化（烘干后食用或鲜食）。近些年铁皮石斛各类产品的营养功能成分方面的研究越来越深入，但目前对铁皮石斛活性组分的研究大多集中在铁皮石斛加工后干样中活性物质总含量的分析，而对其采收后鲜样中活性组分的组成和含量分析的研究则相对较少，有关铁皮石斛中酚类组分或酚酸类组分的分析研究报道更少。本研究在相关方法的基础上，建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定铁皮石斛茎部鲜样13种酚酸类物质的方法，以期为铁皮石斛中活性成分的检测与利用提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

本研究中使用的主要仪器包括UPLC H-Class超高效液相色谱仪（美国Waters公司）、Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪（美国Waters公司）、Millipore Direct-Q5超纯水仪（苏州赛恩斯仪器发展有限公司）、SYG-2水浴恒温振荡器（常州朗越仪器有限公司）、XW-80A旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）。

1.2 材料与试剂

实验样品材料采集自福建省龙岩市连城县、福州市闽侯县铁皮石斛产区，共6份铁皮石斛茎部样品（鲜样）。

13种酚酸类化合物固体标准品：水杨酸（salicylic acid）、对羟基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）、2,5-二羟基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid）、3,5-二羟基苯甲酸（3,5-dihydroxybenzoic acid）、绿原酸（chlorogenic acid）、香草酸（vanillic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、丁香酸（syringate）、对香豆酸（p-coumalic acid）、阿魏酸（ferulic acid）、芥子酸（sinapic acid）、2-羟基肉桂酸（2-hydroxycinnamic acid）、3-羟基肉桂酸（3-hydroxycinnamic acid），纯度≥97%，南京道斯夫生物技术股份限公司生产。甲醇、乙腈，质谱纯，美国Merck公司；乙酸铵、甲酸，质谱纯，美国Waters；Waters BEH C18柱、Waters T3 C18柱，Waters公司。

1.3 标准溶液的配制

分别准确称取一定量的各酚酸类化合物固体标准品，用甲醇溶解，配制成1 000 mg/L的各酚酸类化合物单标母液，然后稀释母液配制成10.0 mg/L的单标储备液，于-20 ℃冰箱中保存。5个浓度梯度的标准混合溶液由各单标溶液经甲醇稀释混合，实验前现配现用。

1.4 超高效液相色谱-质谱条件

1.4.1 超高效液相色谱条件

色谱柱为Waters T3 C18柱（50 mm×1.8 mm，5 µm），柱温保持在30.0 ℃，流速为0.2 mL/min，进样量为4 µL。流动相A为0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈。流动相梯度洗脱条件：0～4 min，30%～90% A；4～6 min，维持30% A；5～8 min，30%～50% A；8～9 min，50%～90% A；9～10 min，维持90% A。

1.4.2 质谱条件

检测方式是电喷雾离子源负离子（ESI-）模式，多反应监测（MRM）；毛细管电压为1.5 kV；锥孔气流为氮气，流速50 L/h；脱溶剂温度为500 ℃，流速800 L/h；离子源温度为150 ℃；雾化气压力为0.28 MPa；碰撞气为高纯氩气。质谱检测定性、定量离子对及优化后的锥孔电压和碰撞能量等具体参数见表1。

表1 酚酸类化合物检测的质谱参数条件

1.5 样品前处理

铁皮石斛中酚酸类组分的提取参考李岩等[9]（2018）的方法。称取0.5 g磨碎后的铁皮石斛鲜样置于棕色锥形瓶中，加入70%甲醇水溶液10 mL,置于恒温振荡器中于70 ℃水浴条件下振荡提取30 min，自然冷却至室温。将提取液转移至离心管中，离心5 min（转速5 000 r/min）后上清液转移至10 mL的棕色容量瓶中。再将样品用70%甲醇水溶液重复提取一次，合并提取液，定容至25 mL、摇匀。铁皮石斛样品提取液经0.45 µm滤膜过滤后，用超高效液相色谱-串联质谱仪分析。

1.6 数据统计分析

数据的统计分析运用Waters MassLynx软件进行处理并用Excel 2007进行分析。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

在质谱仪上采用流动注射泵直接进样方式对13种酚酸类组分检测的质谱条件进行自动调谐优化。用500.0 µg/L或者1 000.0 µg/L（根据各组分相应信号）各酚酸类化合物的单标溶液进行质谱参数优化，以确定特征母离子和子离子对。根据文献报道及酚酸类物质的官能团特点在ESI-模式下进行分析，在子离子扫描模式以及优化的碰撞能量和锥孔电压等质谱参数下，优化获得每种酚酸类组分稳定且强度高的两对离子对。

2.2 色谱柱的选择

实验中，分别使用Waters BEH C18柱和Waters T3 C18柱，考察在不同的流动相体系（甲醇+0.1%甲酸水溶液、甲醇+5 mmol/乙酸铵水溶液、甲醇+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸铵水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液、乙腈+5 mmol/乙酸铵水溶液、乙腈+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸铵水溶液）下所得13种酚酸类组分的峰型和响应信号。实验发现：Waters T3 C18对酚酸类化合物有更好的分离效果，峰型尖锐。从多反应监测（MRM）色谱图（如图1）也可看出，在所检测的目标化合物中，3,5-二羟基苯甲酸与2,5-二羟基苯甲酸，3-羟基肉桂酸与2-羟基肉桂酸互为同分异构体，其峰型虽然相似，但是保留时间有一定的差别，说明在优化的条件下，这些同分异构体也能被T3 C18柱很好地分离，不会造成检测干扰。

2.3 流动相体系的选择

为考察在不同的流动相体系下酚酸类组分的峰型及响应甲信号，对不同流动相体系（甲醇）+0.1%甲酸水溶液、甲醇+5 mmol/乙酸铵水溶液、甲醇+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸铵水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液、乙腈+5 mmol/乙酸铵水溶液、乙腈+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸铵水溶液进行考察。结果表明：采用0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相，在负离子扫描模式下，大多数酚酸类化合物色谱峰基线相对平稳，有良好的峰型及有更好的响应信号。各组分的多反应监测（MRM）色谱图如图1。其原因可能是甲酸的加入有利于抑制酚酸类化合物氢离子的电离，减少其与色谱柱中填料中的基团的静电作用，改善色谱峰的拖尾现象；而乙酸铵的加入有利于酚酸类化合物负离子的形成，能增强响应信号。

图1 13种酚酸类目标化合物多反应监测色谱图

2.4 标准曲线、检出限及定量限

根据酚酸类化合物调谐优化检测参数时的响应情况，配制不同质量浓度梯度的混合标准溶液，得到5个梯度水平的标准曲线工作溶液。以各目标组分响应信号对应的峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X,µg/L），得出13种酚酸类组分的标准工作曲线方程。如表2所示，13种酚酸类组分在相应的线性范围内具有良好的线性关系，决定系数大于0.996。检出限（LOD）范围为0.5～5.6 µg/L（S/N≥3），定量限（LOQ）范围为1.5～15.2 µg/L（S/N≥10）。方法具有较低的检出限和定量限。

表2 13种酚酸类目标化合物检测的线性关系、检出限及定量限

另外，在LC-MS样品分析中，基质效应及共流出组分可能会影响定量分析的准确度。在所分析的组分中，酚酸类化合物的结构相似，部分酚酸类化合物的保留时间非常接近，实验中为考虑共流出组分可能存在的相互影响，将待分析酚酸类化合物混标中该组分的标准曲线的斜率（k0）与单标标准曲线斜率（k1）进行了比较，其比值在0.90～1.10之间。用k0/k1的比值来确定基质效应，比值越接近1，基质效应越小。一般认为，斜率比在0.80～1.20之间，则认为基质效应或者共流出组分影响不明显；反之，则认为基质效应对定量检测具有较大的影响，不可忽略。从实验结果来看，基质效应确实有一定影响，但斜率比在0.90～1.10之间（如图2），对结果分析影响不明显。

图2 共存组分的影响考察

2.5 加标回收率实验

根据样品中酚酸类化合物的含量及标准，按照低、中、高水平加标确定各化合物的加标量，进行加标回收实验，每个加标水平重复6次。实验结果显示，13种组分的加标回收率范围为74.8%～95.2%，相应的相对标准偏差为1.0%～6.9%。由此可见，实验加标回收率在70%～110%之间，回收率满足检测方法要求。

2.6 精密度实验

随机选择1份样品提取液，按照建立的方法进行分析检测，平行进行6次测试。结果表明，所得酚酸类组分数据RSDs在0.046%～0.79%之间，说明该实验方法具有良好的日内精密度，符合分析测定的要求。

2.7 铁皮石斛样品的检测

将采集的样品经前处理后，按所建立的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）对铁皮石斛样品进行检测分析。每次进样量为4µL，重复测定3次取平均值。铁皮石斛茎部鲜样中所含酚酸类化合物的检测结果如表2所示，铁皮石斛茎部鲜样共检出7种酚酸类化合物，其含量在0.187～38.523 mg/kg范围。在所分析的样品中，阿魏酸含量最高，含量为30.32～38.523 mg/kg，其次是芥子酸、丁香酸、水杨酸等，对香豆酸的含量最低。

表3 铁皮石斛鲜样茎部中酚酸类化合物组分及其含量（n=3，单位：mg/kg）

3 结论与讨论

相对于高效液相色谱法（HPLC），超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS-MS）具有灵敏度高、抗干扰能力强、检测线性范围宽、分析快速的等特点，能够较好地实现样品中多组分的快速定性、定量分析，在粮油、中草药、功能性食品相关检测方面发挥出越来越大的作用。铁皮石斛作为“九大仙草之首”，具有良好的保健和药用价值。药典中以石斛多糖、甘露糖及醇浸出物作为铁皮石斛质量控制的指标。而现代科学研究表明，铁皮石斛中其他功能性成分如石斛碱、植物酚类、黄酮类和酚酸类等也有重要生理活性作用。酚酸类化合物含量被认为与自由基清除、抗氧化、抗衰老相关，但是相关对铁皮石斛鲜样中酚酸类化合物的研究较少。原因在于植物性农产品鲜样中所含水分较多且其功能性成分含量较低，诸多仪器的灵敏度较难达到；另一方面由于酚酸类化合物种类较多，而有些酚酸类化合物的结构较为类似，在样品中的含量高低差别却往往较大，从而较难实现不同含量酚酸类化合物的同时检测。

本研究建立了同时、快速检测13种酚酸类化合物的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS-MS），分析了铁皮石斛茎部鲜样中多种酚酸类物质的含量。该方法快速、准确，可为铁皮石斛或者其他植物性农产品中的酚酸类物质的检测提供参考。