灰黄霉素磷脂复合物的制备及释放率研究

张伟光 赵 楠 侯 然 黄月蓉 庞成业 李欣博

(齐齐哈尔大学 化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

灰黄霉素是从灰黄青霉培养液中提取出的一种含氯代谢产物, 为白色或类白色结晶性粉末,无臭,稍有苦味,能溶于无水乙醇、二甲基甲酰胺和丙酮等溶剂,在水中溶解度很小[1]。灰黄霉素属于非多烯类抗真菌抗生素，主要用于治疗头癣、皮肤癣、及手足癣等体表真菌感染，对头癣疗效特别显著[2]。其经皮肤吸收后主要沉积在上皮的角质层，与角蛋白结合，并渗透入毛囊，从而消除真菌感染[3]。灰黄霉素对小芽孢菌、红色癣菌有很好的抑制作用，在农业生产中可以用于防治真菌病害，如一种在苹果授粉时引发感染的念珠菌病[4]。灰黄霉素乳剂含有两性表面活性剂、助乳化剂及助溶剂，具有一定的载药能力，能够使药物处于溶解状态，并具有增加吸收面积、减少代谢等特点[5]。本文将灰黄霉素制成磷脂复合物，从而提高其脂溶性，延长药物的吸收与作用时间，增加生物利用度[6，7]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通仪器有限公司)；微滤膜(0.35 μm截留分子量14 000，大连依利特分析仪器公司)；800型台式离心机(上海浦东物理光学仪器厂); RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SK2200HP超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；SHZ-IIIB循环水真空泵(浙江临海市精工真空设备厂)。

灰黄霉素标准品(上海晶抗生物工程有限公司)；粉状高纯大豆磷脂，自制；灰黄霉素(上海医药集团有限公司信谊制药总厂)；无水乙醇，四氢呋喃，二氯甲烷等均为分析纯。

1.2 磷脂复合物的制备

根据文献[8-10]，称取一定量的大豆粉状高纯磷脂和20 mg灰黄霉素置于150 mL梨形瓶中，加入一定量四氢呋喃-二氯甲烷混合溶剂, 充分混合均匀，并置于超声条件下进行复合反应。超声复合完成后，减压蒸馏除去溶剂，即得灰黄霉素-磷脂复合物。

1.3 灰黄霉素磷脂复合物含量测定

1.3.1 检测波长的确定

配制灰黄霉素标准品的无水乙醇溶液，190～900 nm 范围内进行紫外扫描，其最大吸收波长为290.50 nm,所以确定检测波长为291 nm。

1.3.2 标准曲线

以无水乙醇为溶剂，精密配制灰黄霉素浓度分别为5.0、25.0、50.0、80.0、100.0、120.0 μg/mL的一系列标准溶液。在291 nm处测量以上溶液的吸光度，以吸光度(A)对浓度(C)进行线性回归,得回归方程：A=0.078 2C+0.013 7，r=0.999 6。表明，灰黄霉素在5.0～120.0 μg/mL内浓度与吸光度呈良好线性关系。

1.3.3 精密度实验

精密吸取浓度为25.0、50.0 μg/mL标准溶液各20 μL，重复进样6次，分别测定吸光度， RSD分别为0.46%和0.65%(n=6)。

1.3.4 回收率实验

取灰黄霉素标准品0.002 7、0.005 2、0.006 3 g,分别置于是100 mL容量瓶中，加入20 mL无水乙醇溶解，然后加入50 μg/mL的标准溶液25 mL，再加无水乙醇稀释至刻度。摇匀后进样，测定灰黄霉素的含量。计算得，平均回收率为97.28%，RSD=0.87%(n=3)。

1.4 磷脂复合物复合率的测定

称取已制备好的适量样品置于烧杯中，加入适量正己烷溶解，再经微孔滤膜过滤，收集滤液，减压蒸发去除正己烷，固体用无水乙醇溶解并稀释，于291 nm测定灰黄霉素的吸光度，利用标准曲线回归方程，计算复合物中灰黄霉素的含量。根据初始投料量(M0)与复合物中灰黄霉素的质量(Mt)计算复合率：复合率(%)=Mt/M0×100%。

2 结果与讨论

2.1 正交设计确定磷脂复合物最佳制备条件

2.1.1 正交试验

根据制备灰黄霉素磷脂复合物的初步实验分析, 可知影响磷脂复合物复合率主要因素有:m(磷脂)∶m(灰黄霉素)、V(四氢呋喃)∶V(二氯甲烷)、固液比、超声温度以及超声时间。用L16(45)进行正交试验，确定配方比例见表1。

表1 L16 (45)正交实验的因素和水平

按照表2正交实验设计确定的配方进行实验，以复合率为指标，结果见表2。

从表2中可看出，灰黄霉素磷脂复合物的最佳工艺条件为的实验验号为A3B3C3D3E4，即m(磷脂)∶m(灰黄霉素)=3∶1、V(四氢呋喃)∶V(二氯甲烷)= 1.5∶1、固液比=8∶1、超声温度50 ℃、超声时间150 min。对复合率的影响因素贡献依次为: D>E>A>C>B，即超声温度>超声时间>m(磷脂)∶m(灰黄霉素)>固液比>V(四氢呋喃)∶V(二氯甲烷)。

表2 L16 (45)正交实验结果和分析

2.1.2 验证试验

以A3B3C3D3E4进行三次平行试验，其复合率分别为91.89%，92.06%，91.95%，平均复合率为91.97%，结果与正交实验基本相符。

2.2 体外释放研究

根据文献[11]分别将含有15 mg灰黄霉素的溶液与15 mg灰黄霉素磷脂复合物的悬浮液放入透析袋中，浸入装有150 mL pH7.4磷酸盐缓冲液的锥形瓶中,并以120 r/min的速率搅拌。分别在不同时间取出5 mL溶液并测定灰黄霉素的质量浓度。灰黄霉素的释放率=m1/m0，其中m0是灰黄霉素的初始量，而m1是其释放量。

如图1所示，在初始阶段，灰黄霉素和磷脂复合物的释放速度非常快，最初的3h内接近100%的灰黄霉素及63.73%的复合物释放到了溶液中，在3～11 h阶段，磷脂复合物表现出持续释放行为。

图1 灰黄霉素及磷脂复合物的释放率

3 结论

本文采用溶剂挥发法制备了灰黄霉素磷脂复合物，采用紫外分光光度法测定了其复合率,并通过正交试验确定了最佳制备条件为：m(磷脂)∶m(灰黄霉素)=3∶1、V(四氢呋喃)∶V(二氯甲烷)=1.5∶1、固液比=8∶1、超声温度50 ℃、超声时间150 min。在此条件下，灰黄霉素磷脂复合物的复合率为91.97%。体外释放研究表明，磷脂复合物使灰黄霉素的脂溶性有较大提高，改变了灰黄霉素体外快速释放的特性。