利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼Hand2基因敲除模型

谭志霞 ，张 健，吕 丹，江志钢，袁婺洲，吴秀山，叶湘漓

（1. 湖南师范大学 a. 医学院，长沙 410013；b. 生命科学学院，长沙 410081； 2. 长沙市第九医院检验科，长沙 410004）

心血管病是我国乃至全球范围内第一位致死、致残原因。《中国卫生健康统计年鉴2021》报告显示［1］，我国居民心血管病的患病率处于持续上升阶段，心血管病的现患人数约为3.3亿，每10个成人中至少有2人是心血管病患者。心血管病的疾病负担日渐加重，加强政府主导下的心血管病防治工作刻不容缓。通过研究心脏及血管的发生发育规律，从分子水平阐明心血管病的发病机理，对心血管病的基因诊断与新药研发、最终利用分子干预手段根治心血管病等具有重要的理论和实践意义。

心脏神经脊衍生物表达转录因子2（heart and neural crest derivatives expressed transcript 2，Hand2）是bHLH家族的成员，也称为dHand、Hed和Thing2，可在人以及鼠、鸡、斑马鱼、果蝇等模式动物中表达［2］。1995年，小鼠的Hand2基因被首次克隆［3］；1997年，第一只Hand2基因的传统基因敲除小鼠模型构建成功［4］；2001年，研究人员确认Hand2可在成人心脏中表达［5］。Hand2基因主要与右心室的发育有关，在维持右心室祖细胞和右心室形态发生中起关键作用，并参与神经嵴衍生的心脏流出道和主动脉弓的发生过程［6］。Hand2可与Twist1形成异二聚体，Twist1的突变可能导致机体出现先天性疾病，目前Hand2基因异常参与人类心血管疾病发生发展的具体作用机制尚不完全清楚。

Hand2在进化中高度保守，但其在不同物种中的表达模式存在差异［7］。在小鼠和大鼠的心肌肥厚模型中，Hand2的表达下调［8］；而在病理性心肌病患者的心脏中，Hand2的表达不受影响。有关Hand基因家族在斑马鱼中的研究目前还不多，斑马鱼的Hand2主要在鱼类的侧中胚层表达，参与心脏、肠道以及神经嵴细胞的形成［9］。另有研究显示：Gata4在心血管发育过程中调节Hand2的表达；Hand2的bHLH结构域与Gata4的C末端锌指结构域相互作用，通过与启动子结合激活心脏发生相关基因的表达［10］；Hand2和Gata4与转录因子Mef2c和Tbx5的组合能够在体外将成纤维细胞重新分化为心肌细胞。由此可见，Hand2可能成为心肌梗死等人类心脏损伤的潜在治疗靶点。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼的Hand2基因敲除模型，为后期研究Hand2基因在人类疾病中的作用机制和新型治疗靶点的临床开发等奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

DNA琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、去内毒素质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物公司；Cycle pure kit（PCR产物纯化回收试剂盒）购自OMEGA生物公司；RNeasy Mini kit购自Qiagen生物公司；RTPCR逆转录试剂盒购自Thermo fisher生物公司；T7转录试剂盒购自Promega生物公司；PMD18-T试剂盒购自Takara生物公司；DNA高保真酶试剂盒购自Vazyme生物公司；TrueCut Cas9蛋白试剂盒购自Thermo fisher生物公司；大肠杆菌（E. coli）DH5α感受态细胞菌种由湖南师范大学心脏发育研究中心保存。

1.2 Hand2基因的打靶位点设计

通过生物信息学网站Ensembl（http://asia.ensembl.org/index.html）分析发现斑马鱼（Danio rerio）Hand2基因位于斑马鱼的1号染色体上，包含2个外显子，起始密码子ATG位于1号外显子上，在起始密码子后面的外显子区域设计打靶位点可提高基因敲除的有效性。打靶位点的设计遵循了以下原则：打靶位点碱基长度在18～20 bp左右；前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）区序列严格为NGG（N可为任意碱基）。通过blast分析找到Hand2的1号外显子所在的基因组序列。利用生物信息学网站ZIFIT（http://zifit.partners.org/ZiFiT/）分析1号外显子的基因组序列，筛选得到了两个潜在的靶位点，即Hand2-靶1（GTCGCTGTCATGAAGAACCC）和Hand2-靶2（GGGGGCCGGCGCCGTTGGAA）。设计并合成Hand2基因打靶位点检测引物序列，即Hand2-KO-检测引物F（ACCAAAGCGTACTCCGTCTG）和Hand2-KO-检测引物R（CGAAATGAGGCCATCTGAAC）。

1.3 Hand2基因的打靶位点的sgRNA引物合成

在设计好的靶位点序列之前加上保护碱基tg和T7启动子，靶位点之后加上pUC57-gRNA骨架上游序列作为正向引物序列，pUC57-gRNA骨架的下游序列为反向引物。此外通过生物信息学网站NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计了一对检测打靶有效性的检测引物，检测引物在野生型对照组（wild type，WT）中的目的条带大小为707 bp。

1.4 Hand2基因打靶gRNA的mRNA合成

以pUC57-gRNA质粒为模板，以上述含有靶序列的gRNA正向引物和反向引物gRNA-R进行PCR扩增，得到Cas9-Hand2-gRNA的DNA产物，纯化回收DNA产物后，再进行体外T7不加帽转录合成2个打靶位点的mRNA，通过琼脂糖凝胶电泳观察到转录得到的mRNA后，再加入1.5 μL的DNase，37℃水浴消化剩余的未转录成功的DNA带，用琼脂糖凝胶电泳检测转录出来的mRNA条带。

1.5 显微注射

将上述合成的2个靶位点的gRNA的mRNA与Cas9蛋白各吸1 μL入RNase free-EP管中，按照1∶1∶1的比例混匀，注射到斑马鱼胚胎的Ⅰ-细胞时期中，待3 d左右鉴定注射的有效性。

1.6 Hand2基因打靶F0、F1、F2代基因的有效性检测

收集3 d左右胚胎，分为WT组和Hand2-KO组，每组各收集10颗胚胎，用碱裂解法提取基因组。以提取后的基因组作为模板，用上述合成的一对检测引物进行PCR扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将上述显示为敲除成功的PCR产物进行纯化回收，并送公司测序，阳性结果显示在靶位点附近开始出现双峰。将此PCR纯化回收产物连接到PMD18-T载体上进行转化，待长菌后随机挑取5个单克隆扩增培养，菌液送公司进行测序。

将Hand2-KO斑马鱼F0代胚胎养育3个月左右至成熟后剪尾，每尾鱼的剪尾组织单独放一个EP管，提取基因组，按上述方法筛选出有阳性突变的F0代成鱼。

将鉴定出阳性突变的F0代成鱼分别与WT杂交，获得F1代，检测并筛选出F1代Hand2-KO突变嵌合体。将相同碱基突变的F1代雄性嵌合体与F1代雌性嵌合体自交，可获得F2代纯合突变体，然后提取基因组并进行PCR和测序分析。

2 结果与分析

2.1 Hand2基因打靶位点的设计

利用生物信息学网站设计斑马鱼Hand2基因的打靶位点，如图1和图2。

图1 Hand2基因敲除2个靶位点位置示意图Fig. 1 Schematic diagram of the location of the two target sites for the knockout of the Hand2 gene

图2 Hand2基因敲除打靶位点及检测引物在基因组中的位置示意图Fig. 2 Schematic diagram of the location of the Hand2 gene knockout target site and detection primer in genome上述序列为Hand2基因的部分序列，绿色字体为5' UTR序列，蓝色字体为外显子序列，灰色字体为内含子，红色高亮为起始密码子，绿色高亮为Hand2基因敲除的靶位点1，黄色高亮为Hand2基因敲除的靶位点2序列，橙色字体为3' UTR序列，蓝色高亮为正反检测引物。The above sequence is a partial sequence of the Hand2 gene, the green font is the 5' UTR sequence, the blue font is the exon sequence, the gray font is the intron, the red highlight is the start codon, and the green highlight is the Hand2 gene knockout target site 1, the yellow highlight is the knockout target site 2 sequence of the Hand2 gene, the orange font is the 3' UTR sequence, and the blue highlight is the forward and reverse detection primers.

2.2 Hand2基因sgRNA的合成

设计gRNA的正反向引物序列。在设计好的靶位点序列之前加上保护碱基tg和T7启动子，靶位点之后加上pUC57-gRNA（又名p42250质粒，为环状质粒，见图3）骨架上游序列，作为正向引物序列，pUC57-gRNA骨架的下游序列为反向引物（图4）。Hand2-KO-靶1的正向引物为tgTAATACGACTCACTATAgtcgctgtcatgaagaacccGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；Hand2-KO-靶2的正向引物为tgTAATACGACTCACTATAgggggccggcgccgttggaaGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；gRNA的反向引物（gRNA-R）为aaGCACCGACTCGGTGCCACT；其中tg为保护碱基，T7启动子序列为TAATACGACTCACTATA，横线部分为打靶位点序列，GTTTTAGAGCTAGAAATAGC为gRNA骨架序列上游序列；gRNA-R为通用反向引物，序列中aa为保护碱基。

图3 pUC57-gRNA质粒示意图Fig. 3 Schematic diagram of pUC57-gRNA plasmid

图4 gRNA骨架序列示意图Fig. 4 Schematic diagram of gRNA scaffold sequence红色下横线部分为gRNA骨架序列的上游引物序列；蓝色下横线为gRNA骨架序列的下游引物序列，作为gRNA的反向引物（gRNA-R）。The red underline is the upstream primer sequence of the gRNA backbone sequence; the blue underline is the downstream primer sequence of the gRNA backbone sequence, which is used as the reverse primer (gRNA-R) of the gRNA.

按照上述1.4的方法进行2个打靶位点的gRNA的合成，包括PCR、产物纯化回收和cDNA转录为mRNA，转录出来的mRNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。

图5 Cas9-Hand2-gRNA的电泳检测Fig. 5 Electrophoresis detection of Cas9-Hand2-gRNA （a）Cas9-Hand2-gRNA的DNA产物纯化回收的电泳检测；（b）Cas9-Hand2-gRNA的DNA转录成mRNA的电泳检测；（c）Cas9-Hand2-gRNA的mRNA纯化回收后加DNase消化后的电泳检测。(a) Electrophoresis detection of the purified and recovered DNA product of Cas9-Hand2-gRNA; (b) Electrophoresis detection of Cas9-Hand2-gRNA DNA being transcribed into mRNA; (c) Electrophoresis detection of DNase digested mRNA of Cas9-Hand2-gRNA after purification and recovery.

2.3 Hand2基因打靶的有效性检测分析

2.3.1Hand2-KO-F0代胚胎的打靶有效性检测

将上述合成的2个靶位点的gRNA的mRNA与Cas9蛋白按照1∶1∶1的体积比混匀，注射到Ⅰ-细胞时期的斑马鱼胚胎中，孵育72 h左右，收集3管，每管随机挑取10颗，其中1管为野生型胚胎，进行基因敲除的有效性鉴定（图6）。

图6 Hand2-KO-F0代注射胚胎的有效性电泳检测Fig. 6 Electrophoresis detection of the validity of Hand2-KO-F0 generation injected embryos

为了进一步确定胚胎敲除的有效性，将上述显示为敲除成功的PCR产物进行纯化回收，并送公司测序，结果显示，其在靶位点附近开始出现双峰。随后，将此PCR纯化回收产物连接到PMD18-T载体上进行转化，挑单克隆扩增培养，菌液送公司测序。本研究挑了5个单克隆送测序，其中有4个单克隆是阳性结果。测序结果显示：1号单克隆在1号靶位点附近插入9个碱基的同时缺失6个碱基；2号单克隆在1号靶位点附近有4个碱基插入的同时有5个碱基缺失，在2号靶位点附近有19个碱基缺失；3号单克隆在1号靶位点附近有21个碱基插入的同时有1个碱基缺失，在2号靶位点附近有5个碱基的缺失；4号单克隆在1号靶位点附近有9个碱基插入，在1号和2号靶位点附近有170个碱基缺失（图7）。

图7 Hand2-KO-F0代注射胚胎的有效性检测测序结果Fig. 7 Sequencing results of the effectiveness of the Hand2-KO-F0 generation injected embryos

2.3.2Hand2-KO-F0代成鱼打靶的有效性检测

Hand2-KO-F0代胚胎在培养过程中死亡率很高，培养至3个月左右性成熟后剩余6尾鱼。对其剪尾并提取基因组，进行有效性检测。图8a结果显示，未见明显阳性条带，但不能排除是否有小片段缺失。图8b结果显示，注射组6号斑马鱼在约400 bp处有较弱的阳性条带，可能为突变嵌合体。

图8 Hand2-KO-F0代成鱼的有效性电泳检测Fig. 8 Electrophoresis detection of the validity of Hand2-KO-F0 generation adult fish（a）1～4号Hand2-KO-F0代成鱼剪尾电泳检测；（b）5～6号Hand2-KO-F0代成鱼剪尾电泳检测。M：DNA Marker；WT：野生型对照组。 (a) Electrophoresis detection of clipped tail of Hand2-KO-F0 No. 1～4 adult fish; (b) Electrophoresis detection of clipped tail of Hand2-KO-F0 No. 5～6 adult fish. M: DNA Marker; WT: Wild type as control.

2.3.3Hand2-KO-F2代胚胎及成鱼打靶有效性检测

将F0代突变嵌合体斑马鱼成鱼分别与野生型斑马鱼杂交，得到F1代个体，检测后筛选F1代嵌合体自交，获得F2代纯合突变体，进行鉴定。图9a结果显示，F2代胚胎1号和2号管均出现目的条带。图9b结果显示，F2代成鱼中13号和21号个体在400 bp处发现较弱的阳性条带。

图9 Hand2-KO-F2代的有效性电泳检测Fig. 9 Electrophoresis detection of the validity of Hand2-KO-F2 generation（a）Hand2-KO-F2代胚胎的有效性电泳检测；（b）Hand2-KO-F2代成鱼的有效性电泳检测。M：DNA Marker；WT：野生型对照组。(a) Electrophoresis detection of the validity of Hand2-KO-F2 generation embryos; (b) Electrophoresis detection of the validity of Hand2-KO-F2 generation adult fish. M: DNA Marker; WT: Wild type as control.

3 讨论

斑马鱼是研究心脏发育遗传学和功能基因组学的经典动物模型之一，可以通过遗传修饰来模拟人类疾病［11］。斑马鱼的体型小，产卵量大，养殖成本低，体外受精和发育，早期胚胎透明，易于观察心脏和血管的形态变化以及血流特点［12-13］。在发育的早期，斑马鱼的生存不依赖于循环系统，即使患有严重心脏缺陷的胚胎也能够存活，因而能够用于研究哺乳动物模型中无法适用的基因突变类型，尤其是某些致死性心血管疾病的研究［14］。CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶（zinc-finger nuclease，ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activatorlike effector nuclease，TALEN）之后出现的第三代基因组定点编辑技术，现已在多种模式生物中实现了DNA序列的点突变、大片段基因的敲除以及外源基因的插入等基因修饰［15-17］。凭借着成本低廉、操作方便、效率高、适用范围广等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为生命医学研究的重要技术，并逐渐应用于临床疾病的诊断及治疗［18-20］。本研究中，斑马鱼Hand2基因敲除F0代胚胎基因打靶的效能是很高的，随机挑取的5个单克隆就有4个单克隆出现碱基突变，而且有小片段的缺失、插入，也有大片段的缺失。但是在后期的培育过程中，斑马鱼的死亡率很高，F0代突变嵌合体培养至3个月左右性成熟时仅存活6尾鱼，直接影响到了F1代突变嵌合体和F2代纯合体的筛选与培育，这可能与斑马鱼Hand2基因的种属特异性导致基因编辑后不易稳定遗传、样本基数不足等因素有关。

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了斑马鱼Hand2基因敲除品系，在斑马鱼胚胎水平进行了Hand2基因的敲除，筛选获得了稳定遗传的F2代突变纯合体，为后期的功能研究奠定了重要的基础。