基于相图下的细胞折射率与厚度双波长解耦方法

廖景荣，冒菲菲，王馨云，王子琦，徐媛媛*，薛双双，孙玉娟，王亚伟

（江苏大学 a. 机械工程学院；b. 物电学院，镇江 212013）

细胞是生物的基本单位，其状态关系着整个生命体的健康。而生物细胞的三维折射率分布中含有丰富的关于细胞的外表形态、内部亚结构和生化成分的信息［1］。因此，细胞折射率分布的精准检测对医学诊断和生物学医学研究具有十分重要的意义［2］。在医学临床诊断方面，光子晶体全内反射（photonic crystal-total internal reflection，PC-TIR）生物传感器利用细胞折射率作为唯一的对比参数，实现了单个前列腺癌细胞的检测［3］；膀胱癌组织比正常膀胱组织的散射强度更强，说明其折射率的检测可用于膀胱癌症的临床诊断［4］；特别是癌症早期检测诊断时更加需要细胞相对折射率的精准检测，才能从光谱数据中精确定量地获得细胞的形态信息［5］。因此，细胞折射率的检测方法可成为细胞疾病诊断的一种有效方法。在生物学医学研究方面，神经元放电时，离子浓度的变化会引起细胞折射率的改变［6］；人宫颈癌（Hela）细胞在细胞周期的不同阶段，其折射率会发生相应的改变［7］。此外，细胞折射率分布的检测还可用于细胞免疫学、细胞化学、细胞分子生物学等几乎医学的各个学科方面［8］。

血细胞无色透明的性质使得普通显微镜很难对其结构及内部物质进行清晰的成像［9］，从而出现了若干成像新技术，如超分显微、荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微、光学相干层析成像［10］、数字全息相位显微和定量相位成像技术［11］等。在非光学领域有探针成像技术，如扫描探针显微镜［12］、原子力显微镜［13］和扫描隧道显微镜［14］等。此外，使用X射线辐射成像技术也可对生物细胞进行结构重建［15］。由于上述若干技术尚不能对活性细胞进行快速成像，因此，近十年来定量相位显微技术在活性细胞快速显微成像中脱颖而出，发展迅速。该技术融合了数字全息、光学显微和现代数字图像等技术，与传统检测方式相比，具有无损伤、无侵入、无电离辐射、无需染色、可实时、可定量等优点，该方法已成为活性细胞显微成像的一种主要技术。

对于类球形均质细胞，其形态结构较为简单，折射率检测比较容易，可应用数字全息显微技术［16］和灌水法［17］来检测单介质类球形细胞的折射率。但是许多细胞不具有这样的简单特征，往往为多介质非球体，如白细胞，其折射率的检测就相应要困难。因此，多介质非球体细胞折射率分布检测技术的研究领域得到了国内外众多学者的关注。该类检测方法主要有正交相位成像熵层析法［18］、断层相位显微成像［19］、数字全息显微成像［20］、扫描全息显微成像［21］、定量相位成像法［22］、双波长法［23］、三波长法［24］等。其中正交相位成像熵层析法是依据相位图，通过最大熵方法迭代求出折射率的空间分布，但是空间网格的划分产生了精准度与速度的矛盾；断层相位显微成像、数字全息成像和扫描全息显微成像等主要是利用衍射层析图来解耦细胞折射率，由于采用的是多角度釆集吸收系数投影数据的实验方式，所以实验过程长且计算量大；双波长法［25］和三波长［24］法往往是基于定量相位成像或数字全息显微成像方法来完成的，这些方法需要对相图进行特殊处理并做若干数学假设方能完成。此外，还有许多其他类别的方法，如流式芯片检测方法［26］、微球探针法［27］、固体浸没（solid immersion，SI）显微方法［28］等，这类方法存在着检测对象的个性要求或者是实验平台的特殊设计要求。Shan等［29］基于相位显微成像的优势，利用统计色散关系（statistical dispersion relations，SDR）提出的SDR方法可在不需要厚度分布的情况下获得细胞折射率的精准分布结果，给该领域的研究带来了新启发。

综上所述，基于细胞折射率分布检测的重要意义，人们通过不断的研究，已经获得了许许多多有效的细胞折射率的检测方法，然而由于实验要求高、计算量大等主要因素的影响，折射率检测方法的简单化、精准化的研究仍然是人们努力的方向。由此，针对异形核细胞形态结构复杂、核的形态难以拟合的问题，基于光传输理论和数学分析方法，本文提出了基于双波长三维相位成像下的折射率和厚度的解耦方法。该方法主要应用相移和色散理论，基于相位显微成像技术，利用相位分布和相位梯度分布特征及其与细胞结构形态的关系，得到了双波长相位分布函数表示下的折射率和厚度分布的数学表达结果，由此利用稳定的相位成像技术和比较简单的数学计算，可实现均质和非均质异形核细胞折射率和厚度分布的解耦。仿真实验的结果证明了该方法的有效性。

1 材料与方法

1.1 无核均质细胞的折射率解耦方法

对于均质无核细胞（如红细胞），依据光强传输方程，当光沿z轴透过样品细胞时（为全文说明方便，在此作外胞为球形，内核为椭球形细胞模型，如图1所示），在x-y面接收到的相位函数如下：

图1 三维细胞模型Fig. 1 Three-dimensional cell modelR1为细胞质半径；a、b、c分别为细胞核沿x、y、z方向的半径。R1 is the radius of cytoplasm; a, b, c is the radius of nucleus along x, y, z direction respectively.

式中，λi代表入射波长，nci为不同光源下样品由于色散原因的细胞质的不同折射率，nmi为不同光源下环境液由于色散原因的不同折射率，h（x，y）为样品厚度。

由式（1）可以看出，样品的折射率与厚度信息相互耦合在相位信息中。在双波长相位显微成像中，两个波长下的相移函数如下：

设不同波长下折射率差为δn可得：

而当选用色散系数高的环境液时，δnm>>δnc，由式（2）和式（3）可以得到：

由于环境液折射率可以预先得知，因此，由式（6）和式（7）分别可以得到细胞在不同波长下的折射率，并且可以得到细胞厚度的分布，由此可实现均质细胞折射率和厚度的解耦。

1.2 外胞类球有核细胞的折射率解耦方法

成熟白细胞包括中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞这几类，通常无色、球形、有核结构，且由于表面张力等原因外胞多为类球形，但核多为非球形（图2）。

图2 血细胞形态说明图Fig. 2 Illustration of blood cell morphology

在相位显微成像中，如图1所示，当光沿z轴透过细胞样品时，其相位将产生变化。根据相移理论，双波长下其相位表达式为：

式中，λ1、λ2为光的两种不同的波长，nh1、nh2分别为细胞核在两波长下的折射率，h1（x，y）、h2（x，y）为沿光轴方向细胞质和细胞核的厚度。对沿三个方向（x，y，z）相位成像的相位分布图进行梯度计算可得到其梯度分布图，如图3a～3c所示。依据图3c的相位梯度分布可以找出非核区，即光仅通过细胞质区的相位，此时相位分布可以由式（2）和式（3）表示，因此，在两个波长下细胞质的折射率可由式（7）得到。

图3 梯度分布Fig. 3 Gradient distribution（a）x轴方向梯度;（b）y轴方向梯度;（c）z轴方向梯度。(a) x-axis direction gradient; (b) y-axis direction gradient; (c) z-axis direction gradient.

针对外胞为类球形的细胞，依据对相位图分布外轮廓线的拟合结果，可以得到外胞半径R1（图1），其外胞厚度分布可以表示为：

其中x0、y0为样品中心在坐标系中的原点位置。

式（10）分别对x和y求偏导，可以得到如下表达式：

为求细胞核的厚度分布，上述式（8）对波长求偏导后可以得到如下表达式：

式中，当波长满足△λ=λ2-λ1<<λ1时，△φ=φλ2-φλ1，λ=λ1。

对方程组式（8）、式（9）求空间坐标偏导，式中考虑细胞质和细胞核折射率不变，得到如下表达式：

式中，i对应两个波长，。

选取特定点，确定其坐标，从图3a 、3b中选z轴截点较大处的细胞质与细胞核分界点，设其坐标为（x1，y1），即满足＝0。取其较小的截距视为细胞核厚度，即可得到h2（x1，y1）。由式（10）可以得到h1（x1，y1），将其结果代入式（12）可以得到△nh。如表达式（15）。

又因为△nh-△nc=nh2-nh1-（nc2-nc1）=△nhc2-△nhc1，在式（11）中令可以得到其坐标（x0，y0），将结果代入式（13），推导可以得到：

依据式（10）、（12）、（15）、（16）和（17）可以得到细胞核区的折射率、细胞质和细胞核厚度参量的分布，即可求得nh、nc、h1、h2。

2 结果与分析

2.1 无核均质细胞的仿真结果与分析

正常成熟的血红细胞的形状为双凹圆盘状，而且内部无细胞核及其他细胞器，可被视为均质细胞。为了说明本文方法对无核均质细胞折射率解耦的有效性，建立成熟红细胞均质模型，如图4所示。该模型图由式（18）镜像组合而成，其中b为z轴方向半厚度。

图4 红细胞模型Fig. 4 Erythrocyte model

该红细胞模型中半径为4.00 μm，最大厚度为2.68 μm。光源波长分别设置为532 nm和520 nm。在λ1（532 nm）下的折射率设置为nc1=1.410，λ2（520 nm）下的折射率设置为nc2=1.412。其环境液折射率在λ1下的折射率设置为nm1=1.451，λ2下的折射率设置为nm2=1.475。考虑到实验中噪声的影响，在仿真实验中对相图加入了35 dB的高斯白噪声。

依据本文的方法，仿真实验得到双波长下的红细胞相位分布，如图5所示。图5a和5b分别对应波长532 nm和520 nm下的相位分布。

图5 仿真得到的红细胞相位分布Fig. 5 Phase distribution of red blood cells obtained by simulation（a）λ1=532 nm；（b）λ2=520 nm。(a) λ1=532 nm; (b) λ2=520 nm.

依据本文的解耦理论，仿真计算得到其厚度和折射率分布如图6和图7所示。图6b为结果与模型设置值在最大截面上的比较图，其红细胞厚度分布最大截面的最大相对误差为3.989%。图7b是过红细胞中心的折射率曲线，计算得红细胞折射率nc1与模型值的相对误差为0.264%，折射率nc2与模型值的相对误差为0.405%。由此说明，本文的解耦方法对无核均质细胞折射率解耦有效，并且可以得到较为精准的厚度分布。

图6 红细胞厚度的仿真实验结果Fig. 6 Simulation results of red blood cell thickness（a）厚度3D分布；（b）图（a）过y轴原点的厚度截面分布。(a) 3D thickness distribution; (b) Thickness section distribution across the y-axis origin of (a).

图7 仿真得到的红细胞折射率分布Fig. 7 Refractive index distribution of red blood cells obtained by simulation（a）折射率3D分布；（b）折射率曲线分布。(a) 3D distribution of refractive index; (b) Refractive index curve distribution.

2.2 有核细胞的仿真结果与分析

为了验证该方法的可行性，本文基于MATLAB数值仿真平台进行数值仿真实验。考虑到白细胞中为异形核，在此取细胞核为椭球形（图1）。细胞质外围设半径为8.0 μm，且其中心在坐标原点，椭球核其长、短半径分别为3.5 μm和2.5 μm，光源波长λ1=520 nm和λ2=532 nm，细胞质在两个波长下的折射率分别为nc1=1.469和nc2=1.473，双波长下环境液折射率分别为nm1=1.451和nm2=1.467，细胞核折射率为nh1=1.483和nh2=1.520。考虑到实际实验中的噪声，在仿真实验相位图中加入了30 dB的高斯白噪声。

根据上述参数设置和定量相位成像原理，基于MATLAB平台进行仿真实验，得到两个波长下的相位分布，如图8所示。

图8 相位分布Fig. 8 Phase distribution（a）波长λ1沿x轴方向的相位分布；（b）波长λ1沿y轴方向的相位分布；（c）波长λ1沿z轴方向的相位分布；（d）波长λ2沿x轴方向的相位分布；（e）波长λ2沿y轴方向的相位分布；（f）波长λ2沿z轴方向的相位分布。 (a) Phase distribution of λ1 along the x-axis; (b) Phase distribution of λ1 along the y-axis; (c) Phase distribution of λ1 along the z-axis; (d) Phase distribution of λ2 along the x-axis; (e) Phase distribution of λ2 along the y-axis; (f) Phase distribution of λ2 along the z-axis.

依据本文的解耦理论，在高色散环境液中，δnm>>δnc即可以认为△nc=0，仿真实验得到两个波长下的细胞质折射率分别为nc1=nc2=1.466，两个波长下的细胞核折射率分别为nh1=1.490、nh2=1.545。误差分析表明，波长λ1下的细胞质折射率相对误差为0.175%，波长λ2下的细胞质折射率相对误差为0.426%，细胞核仿真结果nh1与模型值的相对误差为0.444%，nh2与模型值的相对误差为1.436%。具体分析结果如表1所示。由此说明，本文方法对于有核细胞解耦有效。

表1 误差分析结果Tab. 1 Error analysis results

厚度分布仿真实验结果中细胞质的直径为h1（x，y）=15.764 μm，与模型值的相对误差为1.475%，细胞核的厚度h2（x，y）分布如图9所示。图9b中红色实线是过z轴在x-z最大截面上的厚度分布，其最大误差发生在最大厚度值（4.784 μm）处，与模型值的相对误差为4.32%。由此说明，本文方法对异质有核细胞的折射率解耦和厚度分布确定依然有效。

图9 仿真得到的细胞核厚度分布Fig. 9 Nucleus thickness distribution obtained by simulation（a）2D厚度分布；（b）过胞核中心截面厚度分布。(a) 2D thickness distribution; (b) Thickness distribution across the center of the nucleus.

3 讨论

当今细胞折射率解耦技术主要可以分为厚度评估法和层析相位显微法。厚度评估法主要是通过实验结构设置或理论方法来对厚度进行确定，继而实现折射率解耦。这类方法主要存在实验装置设计复杂（如微流控自动配对下的高通量细胞折射率的检测方法）、实验方法会破坏细胞的原生状态（如灌注介质法会使细胞膨胀）、理论计算耗时长（如对厚度进行高斯-牛顿法求解下的非线性最小二乘迭代法求解折射率）等缺点。层析相位显微法主要是通过光源或样品的旋转获取众多角度下的相位分布，从而进行三维重建，由三维相位信息来确定折射率的分布。这类方法虽然具有很高的精准度，能够在任何形态细胞中应用，但是实验装置复杂、实验时间长、计算量大。本课题组提出的最大熵重建方法虽然避免了多角度相位成像，但是重建过程仍然需要一定的计算时间。传统基于相位图下的多波长细胞折射率解耦方法往往需要许多假设条件，如对细胞折射率的预判或者是假设细胞为球体，尚不适应非球形核的细胞。对此，本文所提出的基于三维相位显微成像下的双波长细胞折射率和厚度解耦方法，主要利用无损三维相位显微成像的相位信息，基于双波长相移数学表达，依据色散和相位梯度的特征分析，实现单介质和双介质外胞类球形血细胞折射率和厚度的解耦。本方法通过数值仿真验证实验表明了其可行性。与基于正交相位图下的两波长和三波长传统解耦方法相比较，本文方法对细胞核形态没有要求，但是传统方法由于利用的是正交相图的边缘轮廓作为分析依据［30］，这种情况下只有细胞核是球形时才能够得到精准结果，如果不是球形细胞核形态，只能近似到球形模型处理，此时得到的结果与真实情况比较必然存在着较大的误差，所以本文的解耦方法具有较高的精准性。本方法可对均质细胞（如红细胞）和外胞类球形细胞（如白细胞五个亚类）实现无损折射率和厚度分布的准确解耦，因此在血细胞精准分类中具有重要的潜在应用性，同时也适用于相位体亚结构形态结构的三维重建。