线粒体相关内质网膜调控糖尿病胰岛β细胞内质网应激机制的探讨

刘慧宇，李 汶，刘子璇，李 肖，黄延芹

（1. 山东中医药大学中医学院，山东 250014；2. 山东中医药大学附属医院，山东 250014）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种好发于中老年人群，以葡萄糖代谢紊乱、血糖水平升高为主要特征的内分泌代谢疾病。根据2021年国际糖尿病联盟发布的《全球糖尿病概览》显示，全球成年糖尿病患者数量已达5.370亿例，且中国为糖尿病患者人数排名第一的国家，T2DM人数占其90% 。预测至2045年，中国糖尿病患者数量将达1.744亿例。糖尿病及其并发症已成为21世纪增长最快的全球突发卫生事件之一，已位列人类慢性非传染性疾病的第3位［1］。

T2DM的两大生理病理特征为胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗。胰岛β细胞功能障碍以及胰岛β细胞数目减少导致胰岛素分泌减少。胰岛素抵抗则是由遗传、饮食等内外环境因素诱导外周组织细胞产生应激反应，致使细胞对胰岛素敏感程度下降，导致外周组织的葡萄糖利用度降低［2］。

线粒体-内质网结构偶联又称线粒体相关内质网膜（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes，MAM），最初是在1969年由John在电子显微镜下发现的，直至1990年才由Jean利用生化方法分离出来并正式命名。MAM作为内质网（endoplasmic reticulum，ER）与线粒体之间的动态关联结构，可通过招募所需分子、调节钙离子（calcium，Ca2+）通量等影响细胞基因表达、物质代谢等生理功能。近年来的研究表明，MAM可通过改变结构组分调节ER与线粒体中的Ca2+含量，进而调控胰岛β细胞与外周组织中的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），最终影响胰岛素分泌功能及外周组织胰岛素敏感性，这对T2DM的治疗与研究具有重要意义［3］。本文就 MAM 对ERS的调控作用及其与T2DM的关系作一综述。

1 MAM的结构及其通过调节Ca2+对ER、线粒体影响

1.1 MAM的结构

细胞器之间的膜接触与信息传递的通道随着细胞结构研究的深入越来越受到关注。各细胞器之间并非是独立工作的，而是存在相互联系与交流。虽然这种膜接触面积只占细胞器膜表面的极少一部分，但是对于细胞器及胞质内环境稳态有着重要的介导作用。以MAM为代表，2006年，Csordás等［4］利用透射电子显微镜技术观察到线粒体和ER之间保持着稳定的膜间距，即MAM区域，膜间距通常保持在10～25 nm，且不发生膜融合。2011年，Kornmann等［5］在对酵母细胞的研究中鉴定出了ER-线粒体接触结构（ER-mitochondria encounter structures，ERMESs）的存在，并发现ERMESs是高度专门化的ER和线粒体相关的亚细胞区室，是ER和线粒体之间信息交流的重要场所，其功能上也与ER和线粒体不同。

MAM上存在数十种跨膜蛋白，且富含钙转移通道位点。这些蛋白在ER和线粒体之间搭建了一个复杂多样的物理连接空间结构，此结构为ER-线粒体间的信号交流、Ca2+流通和招募其他蛋白质分子提供了一个平台。所以，ER和线粒体可通过MAM进行双向交流和信息反馈。

MAM上的蛋白主要是来自ER和线粒体的膜蛋白，同时也存在与细胞自噬、炎症相关的蛋白，如1，4，5-三磷酸肌醇受体（inositol 1，4，5-triphosphate receptor，IP3R）、线粒体孔蛋白（voltage-dependent anion channel，VDAC）、钙联接蛋白（calnexin，CNX）、自噬调控蛋白5（autophagy-related 5，Agt5）、线粒体动力相关蛋白（dynamin-related protein 1，Drp1）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）、突触融合蛋白17（syntaxin-17，Stx17）、线粒体融合蛋白2（mitofusin-2，Mfn2）、葡萄糖调节蛋白75（glucose-regulated protein 75，GRP75）等［6］。

在生理状态下，IP3R-GRP75-VDAC形成稳定复合物参与MAM的构成，物理连接两个细胞器，充当ER-线粒体之间的桥联分子，参与Ca2+从ER向线粒体的转运。在细胞发生应激时，GRP75受到抑制，ER-线粒体的连通性减弱，从而达到保护细胞的目的。在ERS时，GRP75与2型转谷氨酰胺酶（transglutaminase type 2，TG2）解离，与ERS膜蛋白IP3R的相互作用增加，致使MAM桥联蛋白组分改变，影响ER-线粒体间Ca2+通量与接触位点数量，改变MAM的功能。由此可知，MAM上的蛋白可调节与生理和病理过程相关的细胞信号通路［7］，对维持MAM稳态具有重要作用，且其功能与ERS通路蛋白相关。

1.2 MAM与Ca2+

MAM是调节Ca2+稳态平衡和氧化还原平衡的关键点。MAM作为ER的一个子域，受ER调控，且与线粒体紧密相连并互相通信［8］。MAM的存在促进了Ca2+从ER向线粒体的转移［9］。研究表明，MAM在调节细胞内钙稳态、线粒体动力学、细胞凋亡和自噬等多种生物过程中有重要意义［10］。

人体细胞内Ca2+含量最多的细胞器是ER，其通过内质网钙转运ATP酶（endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA）来维持Ca2+浓度梯度，并通过调节Ca2+通量调控细胞内或细胞间信号的传导和生理活动［11］。Ca2+作为细胞中的第二信使，参与细胞内酶活性的激活、囊泡释放、细胞自噬与凋亡等过程，因此，Ca2+稳态是维持细胞生理功能和生物结构稳定的重要因素［12］。当ER内蛋白质的合成、折叠、运输障碍或Ca2+的摄取、释放紊乱时会出现ERS，引发未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）降解蛋白，缓解ER压力，但应激强烈且持续存在时，会诱导ER自噬，导致细胞凋亡。

1.3 MAM与ER和线粒体

在ERS时，MAM中ER-线粒体的连接位点数量增加，Ca2+的运输通道数目、运输量增加，细胞质中的Ca2+浓度增加。已有研究证明，参与Ca2+信号传导相关通路的蛋白很多，有位于ER的IP3R、SERCA，还有位于MAM结构中的VDAC、GRP75。ER膜蛋白IP3R通过与分子伴侣蛋白GRP75结合或通过去磷酸化抑制Akt，继而介导ER向胞质内释放大量Ca2+，并通过位于MAM的复合物IP3RGRP75-VDAC进入线粒体外膜，导致线粒体中的Ca2+蓄积［13-14］。

线粒体是细胞内一个微小的动态细胞器，通过氧化磷酸化反应生成ATP，提供大部分人体消耗所需要的能量［15］。Ca2+浓度波动也会影响线粒体稳态的调节。在线粒体膜上有一条由膜蛋白构成的线粒体钙单项转运体（mitochondrial calcium uniporter，MCU）。在MCU的运输下，Ca2+被转移到线粒体基质内，激活氧化代谢的酶系统，增强线粒体内的氧化磷酸化反应，使得线粒体呼吸代谢功能加强［6］。所以，Ca2+浓度及分布会影响线粒体功能，如线粒体膜通透性、线粒体质量控制等［16］。

Ca2+向线粒体的转移必须受到精确的调节。线粒体摄入过量的Ca2+会干扰氧化磷酸化过程，促进线粒体外膜去极化，从而增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，继而诱发氧化还原反应。在ERS早期，ER和线粒体网络向细胞核周围蔓延，ER与线粒体之间的微管连接亦会增加，更多的Ca2+流向线粒体，增加线粒体的呼吸和还原能力［17］。但是，当MAM组分改变时，持续的Ca2+输入会导致线粒体超负荷，诱发线粒体氧化应激，损害蛋白质的加工、转运过程以及Ca2+泵流动调节，间接加剧ERS，最终导致胰岛β细胞凋亡。故MAM会通过改变Ca2+通量间接影响ERS［13，18］。

2 MAM在ERS中的作用

2.1 MAM与ERS相关蛋白

ER是细胞内稳态压力传感器，也是细胞内Ca2+的贮存库，其不仅调控细胞内蛋白质的合成、折叠、聚集与运输，细胞的应激反应以及细胞内Ca2+的储存与释放，还参与脂质代谢［8］。内外环境中的多种因素，如高糖毒性、高脂毒性、氧化损伤、炎症因子等均可影响ER功能的稳态，导致蛋白质翻译错误或折叠障碍。结构错误的蛋白在ER内积聚，进而触发ERS，启动相关级联反应来减少蛋白质的翻译，加快蛋白质的降解，提高蛋白质的折叠能力［9］。剧烈而持久的应激将引起胰岛β细胞功能严重紊乱，进而导致胰岛β细胞凋亡，并且参与多种相关代谢性疾病的发生［19-20］。

ERS会启动相关级联效应，如UPR、内质网超负荷反应（endoplasmic reticulum-overload response，EOR）、固醇调节级联反应，其中UPR是ERS中最重要的保护性反应。UPR通过3条经典信号通路借助ER跨膜受体介导蛋白来发挥作用，受体介导蛋白主要有3个，分别为蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、肌醇需求酶1α（inositol requiring enzyme 1α，IRE1α）和活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）。其共组成3条经典通路，即PERK-真核翻译起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）通路、ATF6通路和IRE1α-X-盒结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP-1）通路，调节基因的表达和蛋白质的翻译。正常生理状态下，伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78 kD，GRP78/Bip）与上述3个跨膜蛋白在ER腔内结合，形成稳定复合物。当发生应激反应时，GRP78/Bip可识别并且与未折叠蛋白结合，引导其折叠、降解，这就导致3个跨膜受体介导蛋白与GRP78/Bip解离，并通过细胞内的结构域实现磷酸化和自身二聚化激活［6，21］。

2.2 MAM蛋白在ERS 3条经典通路中的作用

在ERS的早期，UPR中PERK-eIF2α这一级联反应途径首先被活化，通过抑制蛋白质的合成减轻ER的负担。ER跨膜蛋白PERK活化后通过直接磷酸化底物eIF2α来下调大部分蛋白质翻译。因为不需要经过细胞核转录、翻译，所以其能非常迅速地发挥抑制效应，有效减少蛋白质的合成。PERK是ER与MAM的连接蛋白，而eIF2α是富集于MAM处的一种跨膜蛋白，PERK-eIF2α持续激活使得ER和线粒体之间传递的ROS生成增加，导致钙超载及线粒体形态和功能改变，引起细胞凋亡［13］。同时，PERK会促进活化转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）优先转录，通过上调促凋亡相关蛋白C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、Bcl2相关蛋白x（Bcl2-associated x，Bax）激活细胞凋亡程序［6］（图1）。

激活ATF6通路是UPR的第二条效应途径。在非应激状态下，ATF6与GRP78稳定结合，并处于无活性状态。ERS时，ATF6-GRP78解离，ATF6移位至高尔基体被切割，释放出胞内片段，P50迁移至细胞核内使ATF6活化，活化的ATF6的N端切割段可位移至核内，促进含ER压力相应元件的转录因子（如伴侣分子GRP78、CHOP、XBP-1等）转录，并与ATF4因子共同作用，增强ER的蛋白质的降解能力和折叠能力，缓解ERS［22-24］。但其与MAM的相关联系至今尚未找出明确的证据来证明［6］（图1）。

图1 MAM主要结构及在ERS中的作用Fig. 1 Main structure of MAM and its role in ERS

第三条效应途径是IRE1α-XBP-1通路，是最保守的UPR信号分支。IRE1α是特定位于MAM的传感器，在受到ERS刺激后，其与伴侣蛋白GRP78解离，通过磷酸化激活自身的核糖核酸内切酶活性，可剪切无活性的XBP-1前体mRNA，切割出26个内含子核苷酸。剪接后的XBP-1 mRNA位移至细胞核，经翻译后形成有活性的转录因子剪接型X-盒结合蛋白1（spliced X-box binding protein 1，XBP-1s）。XBP-1s可以调节多个UPR靶基因的表达，增加蛋白质的折叠能力［22，24］。同时，活化的IRE1α调控MAM中IP3R的分布，增加其活性，导致大量Ca2+进入线粒体，使线粒体腔内钙超载，氧化应激加剧，ROS积聚，进而导致细胞死亡［16］。激活的IRE1α还可以与肿瘤坏死因子受体相关因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2）等形成多蛋白复合物，激活c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路，诱导细胞凋亡［19］（图1）。

由于在正常生理状态下IRE1α的作用底物XBP-1 mRNA的表达非常低，且部分XBP-1 mRNA的转录受ATF6调控，因此，IRE1α的效应要晚于PERK和ATF6信号途径［20-24］。

3 MAM结构完整性、ERS与胰岛素抵抗 发生的关系

糖尿病患者初期会由于胰岛素相对不足导致胰岛素抵抗，出现高胰岛素血症。其产生的原因主要为胰岛素受体信号通路结构改变导致外周组织包括肝脏、骨骼肌和脂肪组织细胞对于胰岛素的敏感性降低，对于葡萄糖的摄取和利用率降低。胰岛素作用于外周组织的信号通路，如Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）复合物2以及磷酸酶及张力蛋白同源物等，可以定位到MAM并与MAM中的结构蛋白相互作用，表明MAM结构稳定性对于外周组织胰岛素信号传导可能有重要作用［25］。

3.1 MAM结构受损诱导胰岛素抵抗

越来越多的证据表明，MAM受损会加速多种代谢性疾病的发生，如糖尿病及其并发症、肥胖、高脂血症、高血压等。MAM受损可诱导ERS和线粒体氧化应激，使胞内Ca2+信号传递、脂质代谢等生理活动紊乱，从而下调胰岛素信号传导。人体肝脏、骨骼肌产生胰岛素抵抗的一个共同特征就是MAM结构改变［25-27］。

MAM中ER-线粒体接触位点的完整性似乎对正确的胰岛素信号传导至关重要。有研究通过对比切断和恢复ER-线粒体接触位点观察到，来自体内模型的原代肝细胞对胰岛素的反应可以转为正常化［28］。

磷酸化的Akt为响应胰岛素信号而被募集到MAM界面上，且定位在IP3R附近。Akt可以直接磷酸化和抑制IP3R的功能，导致ER释放Ca2+减少，细胞基质中Ca2+信号传导减弱，引起胰岛素抵抗［25］。

3.2 ERS诱导胰岛素抵抗

葡萄糖代谢受Ca2+信号传导调控，包括糖异生和葡萄糖利用。胰高血糖素会间接导致IP3R的磷酸化和激活，从而导致胞质中Ca2+浓度增加，故活化的IP3R间接上调糖异生基因的表达，并促进糖异生，导致血浆葡萄糖水平升高［29］。其次，Ca2+信号通过调节胰岛素信号通路影响葡萄糖的生物利用度，IP3R促进葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter type 4，GLUT4）与质膜融合，增加葡萄糖摄取的过程也是Ca2+依赖性的［30］。所以，在ERS早期，MAM结构中IP3R-GRP75-VDAC解离，IP3R活化，线粒体-ER的Ca2+通道位点增加，Ca2+通量增加，葡萄糖利用度增加的同时，糖异生作用也增强。

持续ERS时，JNK以依赖IRE1α底物的方式活化，过度活化的JNK会抑制胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）的酪氨酸磷酸化，阻止胰岛素信号的传导，降低胰岛素在外周组织的敏感性，从而抑制外周组织对于葡萄糖的摄取，血浆中葡萄糖浓度下降缓慢，导致胰岛素抵抗［31］。研究发现，在糖尿病、肥胖小鼠模型中，PERK信号分支会导致小鼠肝脏内Tribbles同源蛋白3表达增加，通过上调ATF4提高CHOP的表达，从而导致小鼠肝细胞发生胰岛素抵抗［32］。

4 MAM在现代医学治疗T2DM中的应用

以上内容叙述了MAM中膜介导蛋白结构变化在T2DM患者机体中表达失调导致Ca2+紊乱，同时也表明两者之间存在双向影响作用。有证据表明，Akt信号在肥胖、T2DM模型小鼠的肌肉细胞中均受损［33-34］，与胰岛素抵抗的联系表明，其可用作治疗T2DM的靶点。二甲双胍作为T2DM临床治疗的一线口服药物，可部分通过MAM生物学的修饰发挥作用［35］，已被证实可以通过激活AMP依赖的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）发挥作用，会引起AMPK向MAM易位，并通过Mfn2增加ER与线粒体的接触位点，拯救细胞自噬缺陷。同样，其他研究发现罗格列酮也可以增加胰岛素抵抗模型小鼠的ER-线粒体接触位点，可以更好地改善葡萄糖耐量［36］。Bassot等［37］研究发现，一氧化碳等物质可以通过MAM改善胰岛素抵抗。

从中医药学角度来看，根据全国名老中医程益春提出的“脾虚致消”理论总结的健脾消渴方可干预高糖损伤的小鼠胰岛β细胞株，改善胰岛β细胞ERS，通过调节AMPK/mTOR自噬抑制凋亡，促进胰岛素分泌［38］。同时也有试验证明，中药单体白藜芦醇可以通过下调PERK、ATF4、GRP78的蛋白水平来降低ERS造成的细胞凋亡［39］。所以，通过中医药来改善胰岛β细胞ERS、维持MAM结构稳态具有重要的研究意义，为现代医学治疗T2DM提供了新方向。

5 总结与展望

目前，对于T2DM的发病机制尚未完全明确，且处于探索阶段，虽然有完善的疾病诊疗指南，但并无特效药可以控制T2DM的发生与进展。依据上文总结，胰岛β细胞ERS与T2DM的发生发展存在密切联系，其关键节点在于剧烈而持久的ERS会导致胰岛β细胞功能受损，甚至触发细胞凋亡。MAM作为连接ER与线粒体的蛋白偶联通道，对于影响ER和线粒体的功能具有双向调节作用。MAM结构完整性和接触位点的数量对于介导ER、线粒体招募相关蛋白分子、Ca2+流动等信息传递的实现具有重要意义。因此，是否可以通过维持MAM结构稳定性调控Ca2+稳态，通过靶向影响UPR的3条经典通路PERK-eIF2α、IRE1α-XBP-1、ATF6通路来减轻ERS、氧化应激，继而保护胰岛β细胞功能、避免细胞凋亡，增加外周组织胰岛素敏感性，抑制T2DM病程进展，具有重要的研究价值。