青藤碱对IL-1β诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖及炎症因子的影响

秦玉雪，郭美珠

(上海市宝山区中西医结合医院，上海 201999)

青藤碱(sinomenine,SIN)是防己科植物青藤Sinomeniumacutum(Thunb)Rehd.et Wils.的主要提取物，作为传统草药，青藤在我国历代本草和药典中均有收载，始载于宋代《图经本草》，为众人所知。其主治疾病有风寒湿热等外邪侵袭所致的风湿痹痛、经络不通及小便不利等。多项研究显示，目前已存在多种中药制剂如正清风痛宁、盐酸青藤碱及毛青藤等，含有青藤碱，此类复方制剂在治疗免疫系统、心血管及肿瘤等方面均有可观的效果，在治疗关节炎性疾病时效果更显著，逐渐成为治疗该类疾病的首选药物。现代药理学研究表明，青藤碱主要具有抗炎镇痛[1]、抑制炎症因子分泌和表达、免疫抑制[2]、镇痛[3]及免疫调节作用，具有毒性温和、不成瘾的优点[4]。近年来因青藤碱独特的免疫调节特性而受到海内外研究者的重视。类风湿关节炎和强直性脊柱炎主要特征为炎症细胞浸润、滑膜增生以及软骨受损最终导致骨侵蚀及骨破坏[5-6]。本实验通过观察青藤碱不同浓度对大鼠滑膜细胞株IL-1β诱导下RSC-364增殖率的影响，以及观察细胞上液中炎症因子IL-6、MMP的表达变化，为青藤碱治疗炎症性相关疾病、抗炎药物机制的研究奠定了理论基础，为中医药临床应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

大鼠滑膜细胞株RSC-364 (北京北纳创联生物技术研究院)；青藤碱(上海源叶生物科技有限公司)；Rat IL-1β(R&D Systems公司)；胎牛血清、DMEM培养基(Sigma公司美国)；Cell CountingKit-8检测试剂盒(碧云天生物公司)；IL-6、MMP-3 ELISA(酶联免疫吸附测定)；试剂盒(Multisciences 联科生物)。

1.2 仪器

酶标仪Thermo Multiskan MK3(Thermo fisher公司)；XTL-47细胞洗涤离心机(上海市离心机械研究所)；Thermo-37型CO2培养箱(Forma，美国)；Olympus—CK2相关显微镜(Olympus，日本)；LXJ-IIB水平离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.3 细胞培养及分组

细胞RSC-364置于细胞培养基DMEM内，培养至对数生长期，用0.25%的胰酶消化细胞，用培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度为2×104个/mL。向96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液，37 ℃培养至细胞贴壁后，给予不同剂量的青藤碱和IL-1β，分组如下：青藤碱不同浓度(0、80、160、240、320 mg/L)组，青藤碱不同浓度+IL-1β组，1 h后再加入10 ng/mL的IL-1β；48 h后每孔加入10 μL Cell CountingKit-8，37 ℃孵育1 h后在酶联免疫检测仪上450 nm处测定吸光度。每组实验数据均进行3次重复实验，计算出平均值。

1.4 不同剂量青藤碱对大鼠滑膜细胞RSC-364增殖的IC50检测

1.5 血清IL-6及MMP-3测定

以上细胞上清液，-70 ℃保存，采用ELISA法试剂盒检测IL-6、MMP3的水平。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 不同浓度青藤碱对大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖率的影响

由图1可见，分别给予青藤碱0、80、160、240、320 mg/L，48 h后，大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖率与青藤碱组0 mg/L相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。随着青藤碱浓度增加，细胞增殖率逐渐降低(P<0.05)，见表1。

注:A.青藤碱0 mg/L；B.青藤碱80 mg/L；C.青藤碱160 mg/L；D.青藤碱240 mg/L；E.青藤碱320 mg/L。图1 各组大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖情况(×10)

2.2 IL-1β诱导下的不同浓度青藤碱对大鼠滑膜细胞株RSC-364的增殖情况

不同浓度青藤碱组(0、80、160、240、320 mg/L)与IL-1β诱导下青藤碱组(0、80、160、240、320 mg/L)作用48 h后相比，青藤碱浓度越高，细胞增殖率较前明显减少(P<0.05),由此可见，IL-1β可促进细胞增殖有效,见表1、图2。

表1 各组对大鼠滑膜细胞株RSC-364细胞增殖情况影响

注:A.青藤碱0 mg/L+IL-1β；B.青藤碱80 mg/L+IL-1β；C.青藤碱160 mg/L+IL-1β；D.青藤碱240 mg/L+IL-1β；E.青藤碱320 mg/L+IL-1β。图2 IL-1β诱导下的各组大鼠滑膜细胞株RSC-364细胞增殖情况(×10)

2.3 青藤碱对于大鼠滑膜细胞RSC-364的半数致死浓度IC50的测定

大鼠滑膜细胞RSC-364给予不用剂量青藤碱，进行细胞增殖实验，结果发现随着青藤碱浓度的增加，细胞增殖率降低，并获得药物对于细胞RSC-364的IC50为139.8 mg/L，见表2。

表2 各组不同浓度青藤碱对大鼠滑膜细胞RSC-364增殖率

2.4 不同浓度青藤碱对IL-1β诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364炎性因子IL-6的影响

由表3可见，青藤碱不同浓度组、青藤碱不同浓度+IL-1β组对IL-6分泌水平均呈显著的抑制趋势(P<0.05)。

表3 不同浓度青藤碱对IL-1β诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364炎症因子IL-6的影响

2.5 不同浓度青藤碱对IL-1β诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364分泌MMP-3的影响

由表4可见，青藤碱不同浓度组、青藤碱不同浓度+IL-1β组对MMP-3分泌水平呈显著的抑制趋势(P<0.05)。

表4 不同浓度青藤碱对IL-1β诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364分泌MMP-3的影响

3 讨论

类风湿关节炎和强直性脊柱炎是常见的、严重的慢性炎症性自身免疫系统疾病，在中医的辨证论治理论体系中都归属为“痹症”，在风湿免疫病体系中，早期的医家并未将强直性脊柱炎作为一种独立的疾病进行认识，而是将其作为类风湿关节炎的一种特殊类型，为类风湿关节炎的“中枢型”或者“类风湿脊柱炎”，共同的特点为病势迁延难愈。滑膜细胞的增殖、多种炎性细胞浸润最终导致软骨和骨骼的破坏是类风湿关节炎和强直性脊柱炎主要的病理表现[7-8]。在病理情况下，活化状态下的炎性细胞可分泌促炎介质并且激活滑膜成纤维样细胞，被激活的滑膜成纤维样细胞可以产生促炎细胞因子和趋化因子进一步促进炎性细胞激活、分化及关节滑膜的改变，是导致关节变形和破坏最主要的病理改变之一[9]。在炎症关节炎发病的过程中，炎性因子IL-1、肿瘤坏死因子-α及IL-6等在疾病活动中地位尤为主要。类风湿关节炎和强直性脊柱炎免疫过程中细胞因子起到直接参与作用，对促进滑膜炎症，特别是后期的软骨的破坏等方面均有很大的作用[10]。在类风湿关节炎和强直性脊柱炎的发病过程中炎性细胞因子IL-1β是关键的参与者，在其中起到重要作用，也是在IL-1成员中是最主要的炎症因子，同时也是一种高度炎性的细胞因子，可以介导自身炎症性疾病[11]。在滑膜炎症与骨和软骨的破坏过程中IL-1β和肿瘤坏死因子-α在关节滑膜细胞中的分泌显著增多，大量的促炎介质、趋化因子以及前列腺素等释放，造成关节滑膜炎症的发生，引起滑膜细胞大量增殖，最终导致骨的破坏[12]。研究证实，关节炎及骨质破坏的严重程度与滑膜生成的IL-1β的含量有直接相关性。深入机理研究表明[13]，青藤碱的抗关节炎作用可能与其对滑膜成纤维细胞的抗增殖作用以及对关节组织的保护作用密切相关。在本次实验的研究过程中，通过在细胞因子IL-1β诱导下大鼠滑膜细胞株RSC-364增殖建立了滑膜细胞炎症产生的体外模型,分析青藤碱在不同浓度的情况下大鼠滑膜细胞株RSC-364在 IL-1β诱导下的增殖情况。实验发现，青藤碱在不同浓度的情况下对大鼠滑膜细胞在细胞因子IL-1β的诱导下增殖作用显著受到抑制,减少了滑膜的炎性浸润。在实验的观察过程中,细胞因子活性和炎症介质的含量具有明显的剂量依赖性。本研究为更深入地阐释青藤碱作用机制以及更好地扩大药物临床应用提供了理论依据。

因此，在类风湿关节炎和强直性脊柱炎的治疗过程中，有效的控制病变中滑膜细胞的过度增生是需要解决的重要环节。张群燕等[14]研究表明青藤碱在滑膜细胞增殖、凋亡方面有良好的作用。许多实验表明青藤碱在治疗强直性脊柱炎方面具有良好的作用[15-16]。在风湿病的发病过程中，关节局部炎症细胞的浸润及炎性细胞因子大量产生是引起风湿病炎症反应的重要因素。抑制炎症介质的产生，对迅速缓解风湿病患者出现的各种疼痛和肿胀非常重要。青藤碱是我国传统中药提取物之一，在中医药治疗中承担了重要的角色，因此具有较好的实验及临床开发价值。研究中发现青藤碱可通过平衡炎症细胞因子、干预免疫反应通道、神经保护、抗血管生成、调控基因表达及影响重要信号通路等机制起到治疗效果[17],可以有效地控制AS和RA临床症状。有文献表明对类风湿关节炎纤维样滑膜细胞运用中药抑制有良好的作用，且在减少滑膜增生方面尤甚[18]。在近些年的相关研究中，对炎症因子进行多项相关疾病所产生的重要作用均被证实，其中细胞因子的靶向治疗具有很好的疗效，而且在疾病的预后方面有更多的改善。

在类风湿关节炎和强直性脊柱炎疾病发展过程中病变主要部位发生外周及在中轴的关节，有相关研究发现,当受累的关节发生炎性改变时，滑膜细胞的过度增殖以及炎性细胞因子的出现，是导致患者关节骨质被炎症破坏的重要要素。与上述的IL-1β在强直性脊柱炎和类风湿关节炎发病中相似的作用，IL-6也是参与其中起到关键性作用细胞因子之一，在参与滑膜炎症，以及疾病后期软骨的破坏及骨吸收起到主要的作用。血清、关节液中IL-6浓度的高低变化在类风湿关节炎和强直性脊柱炎的病情活动和进展具有显著的关联性。根据研究表明[19]IL-6的浓度水平不同对其产生的作用存在差异，在低浓度水平下表现为免疫调节的作用，在高浓度水平时则开始对关节产生了病理性的损伤。研究表明IL-6在强直性脊柱炎的疾病发生发展过程中起到了重要的作用[20]。肖敬等[21]进行的实验阐述了青风藤能够有效地减低大鼠滑膜组织中IL-6 的含量，可以显著地控制炎症介质的浸润,起到保护骨关节的作用，延缓了疾病过程中骨质的破坏。郑洁等[22]表明高剂量的青藤碱可显著降低关节液中IL-6,表明青藤碱抑制滑膜炎，保护关节软骨与量的高低有关。显然在类风湿关节炎和强直性脊柱炎的病变过程中对滑膜细胞的炎症因子IL-6的控制起到中重要的作用。本实验选用青藤碱在不同浓度的情况下大鼠滑膜细胞株在10 ng/mL的IL-1β诱导下分析RSC-364的增殖及对产生的炎性介质IL-6进行检测含量，经过以上实验得到的结果显示，青藤碱可使关节模型中的炎性因子IL-6的含量降低。青藤碱能抑制Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠巨噬细胞中IL-1β和IL-6的产生，降低血清中IL-1β和IL-6的浓度[23]。研究表明[24],青藤碱显著抑制IL-6的分泌，对骨破坏具有保护作用。因此IL-1β、IL-6等炎症介质在关节滑膜炎症时起着重要的作用。青藤碱可以抑制巨噬细胞中 IL-1β和IL-6的产生，并降低CIA大鼠的血清 IL-1β和IL-6的浓度，从而减轻滑膜细胞的炎症反应。故青藤碱在治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎可通过对IL-6抑制，可能与其缓解关节滑膜的炎症机制有关，这可能成为将来治疗的重要的靶位[25]。

基质金属蛋白酶是一种内源性蛋白水解酶，能够分泌多种细胞因子，可直接降解软骨和骨质，被认为是破坏关节软骨最为重要蛋白酶。在疾病活动时首先激活MMP-3(金属基质蛋白酶3,matrixmetalloproteinase-3)，然后使其他的蛋白酶活化。滑膜细胞、软骨细胞以及成纤维细胞等都可以分泌MMP-3。过度增殖的滑膜细胞中含有MMP-3，其活化可导致多种蛋白酶降解，是骨破坏骨侵蚀中起着重要作用的一种酶。因为MMP-3直接参与了骨关节的破坏[26],大量的研究表明免疫性疾病患者血清 MMP3 水平明显升高，该指标可作为疾病活动性和疗效评估的指标之一[27-28]。在类风湿关节炎和强直性脊柱炎发病时血清及关节液中的基质金属蛋白酶含量较前明显升高，其蛋白和基因均过度表达，青藤碱可直接显著抑制金属基质蛋白酶3表达使其生成减少，对减轻患者关节的破坏非常有意义。有学者进一步实验证实青藤碱抗CIA小鼠关节炎的机制与CIA小鼠关节滑膜腔内MMP1及 MMP3 的水平下降有关[29]。有研究表明MMP3可能与强直性脊柱炎的易感性有关，是潜在诊断生物标志物[30]。还有研究表明MMP-3和MMP-9在 RA 滑膜炎和心血管变化中起着关键作用，使它们成为重要的治疗靶点[31]。本实验研究结果表明青藤碱对大鼠滑膜细胞株RSC-364的炎性因子MMP-3分泌水平呈显著抑制作用，从而得知青藤碱对减轻关节的破坏非常有意义。通过本实验，我们得出如下结论：青藤碱在不同浓度的情况下对大鼠滑膜细胞株RSC-364在IL-1β诱导下的增殖具有显著的抑制作用，并呈剂量依赖性，与此同时还可明显降低炎症因子IL-6、MMP-3的表达水平。由此说明青藤碱具有抑制关节滑膜炎症、增生以及炎症介质释放作用。