60Co-γ辐射紫花苜蓿分化苗对高温胁迫的生理响应

李 波，刘 畅，冯成龙, 李姗姗， 金姗姗，赵金诺，刘家佑，张君辉, 姜思琦, 石婉莹

(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

温度是影响植物生长的重要因素，高温导致植物叶片及根系生长受阻，使植物抗病虫能力下降，产量降低[1]。紫花苜蓿是世界上种植范围最广、经济价值最高的优质豆科牧草，但高温限制了苜蓿(MedicagoSativaL.)种植范围并影响其鲜草的产量及质量[2]，因此应加快对耐高温苜蓿新品种或品系的选育。辐射育种是利用物理诱变因子引起作物染色体、基因和细胞质异变，从而获得性状改善的方法。辐射育种中60Co-γ辐射是最为有效的方法之一[3]，利用60Co-γ射线能选育出性状优良的牧草新品种，谢新春等[4]研究60Co-γ射线诱导结缕草(ZoysiaJaponicaS.)性状变异，获得综合性状良好突变株‘80-1’和‘10-1’。辐射处理可以诱发植物遗传物质改变，组织培养过程中也能够产生一些变异，将两者结合起来进行双重变异，可以在有限的时间内进行大群体筛选，从而提高辐射诱变的效率[5-6]，但关于此方面的研究鲜见报道。由于体细胞无性系变异的发生往往没有方向性, 变异类型繁多, 且劣变机率大于优变, 而用于植物育种目标的变异则必须是优良性状[7-8], 因此对变异进行有效的筛选至关重要。采用高温等环境处理，获得抗性愈伤组织或抗性细胞系，然后再生获得抗性突变株，该方法主要用于抗逆性选育，筛选得到的突变体一般要进行生理生化和分子生物学的鉴定[9-10]，为进一步育种应用奠定基础。杨曦[11]通过对愈伤组织进行高温胁迫处理，获得了茶用菊花(Chrysanthemum) 耐热变异体，潘林等[12]研究辐射苜蓿愈伤组织对高温胁迫的生理响应，发现一定辐射剂量可以提高苜蓿愈伤组织耐高温能力。

畜牧业的发展长期受到饲料供应短缺和对国外依赖度高的制约，因而选育适合高温地区生长的优质牧草具有重要的应用价值。本研究探究60Co-γ辐射处理和高温环境下紫花苜蓿分化苗生理特征，以期为探讨苜蓿耐高温驯化的途径及运用辐射处理来提高苜蓿耐高温能力提供依据。

1 材料与方法

1.1 苜蓿种子培养

60Co-γ 射线辐射的龙牧 806 苜蓿(MedicagoSativaL.)种子于 2017 年在中国农业科学院原子能利用研究所进行辐射处理，将同批次的辐射(辐射剂量为600 Gy和800 Gy，剂量率为15 Gy·min-1)和未辐射苜蓿种子种植在黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院试验基地，收获后获得辐射第二代(M2)和未辐射的苜蓿种子。将以上苜蓿种子用35℃温水浸泡2 h，播种于育苗盆中(营养土∶珍珠岩=2∶1)，每盆播30粒种子，每个剂量10盆，置于温室内培养75 d后筛选变异植株，将获得的高株G3(800 Gy)和G4(600 Gy)的叶片愈伤组织分化组培苗[13]，对照为未辐射苜蓿植株叶片愈伤组织分化组培苗,分别记为G3、G4、CK，见图1。

图1 苜蓿分化苗

1.2 高温胁迫温度及时间的选择

将CK分化苗接种于MS基本培养基，每个培养瓶接种6个单芽茎段，待培养至带有4～5个茎节和根系时，将相同数量的分化苗培养瓶分别置入25、30、35、40、45℃光照周期为12 h/12 h的光照培养箱中，各培养1、2、3、4、5、6 d，高温胁迫结束后统计存活率，确定有效的高温胁迫温度和天数。

将CK、G3和G4分化苗分别在筛选的温度和天数下进行高温胁迫，以未高温处理的CK、G3和G4分化苗为对照。

1.3 生理生化指标的测定

采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量；可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量采用蒽酮比色法测定；Pro 含量采用酸性茚三酮法(Proline，Pro)测定；相对电导率(Relative conductivity，RC) 采用电导法测定; MDA ( Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定；过氧化物酶(Peroxidase，POD) 活性采用愈创木酚比色法测定；过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性采用分光光度法测定；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD) 活性采用 NBT 光化还原法[14]测定。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 21.0统计学软件进行显著性分析和相关性分析。对测得数据用模糊数学隶属度公式进行转换,隶属函数公式为:

U(Xij)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

反隶属函数公式为：

U′(Xij)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中,U(Xij),U′(Xij)分别为第i个胁迫处理的j项指标的隶属值和反隶属值,Xmin和Xmax分别为j项指标的最小值和最大值。

耐高温系数=(不同胁迫处理下平均测定值/对照平均测定值)×100%

权重系数Wi=Ri/∑R，Wi为i指标的权重系数，Ri为某一指标的权重，∑R为各指标的总权重。

综合评价(D)=隶属函数值×权重系数

试验数据用SPSS 19.0和Excel软件进行统计分析，采用单因素方差分析法(ANOVA)比较不同处理间的差异显著性，P<0.05时有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫温度及时间的确定

CK分化苗在不同温度处理下，对苜蓿分化苗存活率产生一定的影响。25～35℃分化苗处理1、2、3、4、5 d和6 d的存活率均为100%，40℃高温胁迫下分化苗处理1、2、3、4 d和5 d的存活率分别为100%、100%、80%、64%和22%，时间再延长分化苗无法存活；在45℃高温处理1 d存活率极低，2～6 d存活率均为0。根据40℃处理1～6 d分化苗存活率，绘制存活率与处理时间关系图(图2)，依据回归方程(y=-25.8x+155.6，R2=0.9854)可知40℃下半致死胁迫天数为4.09 d，致死胁迫天数为6.03 d，因此选择40℃高温处理1～4 d的分化苗进行生理生化指标测定分析。

图2 苜蓿分化苗在40℃高温胁迫下存活率的变化

2.2 辐射和高温胁迫对苜蓿分化苗渗透调节物质含量的影响

SP，SS和Pro在细胞质内积累，作为渗透调节物质可调控植物抗逆能力。高温对苜蓿分化苗SP、SS和Pro含量影响见图3，在40℃高温胁迫下，3组苜蓿分化苗(CK，G3，G4)SP含量均随高温胁迫时间延长呈先增后降的变化趋势，SP和SS含量分别在高温胁迫2 d和3 d达最大值，CK分化苗Pro含量在高温胁迫2 d达最大值，G3、G4分化苗在高温胁迫3 d达最大值。G3和G4分化苗在未高温胁迫下，SP含量分别为CK的2.49倍和7.32倍，SS含量分别为CK的1.44倍和2.12倍，Pro含量分别为CK的1.55倍和1.32倍，辐射苜蓿分化苗的SP、SS和Pro均高于未辐射苗。

注：图中不同小写字母表示各处理在不同胁迫时间下差异显著(P<0.05), 下同。

在40℃高温胁迫下，G3和G4分化苗SP含量均高于CK，胁迫3 d分化苗SP含量最高，CK、G3、G4分化苗SP含量较其未胁迫组分别增加了530.78%、235.74%和21.32%(P<0.05)；在高温胁迫的不同持续天数，3组分化苗SS和Pro含量变化无明显规律，CK、G3和G4分化苗在高温胁迫3 d时，SS含量较其未胁迫组分别增加了157.16%、79.21%和61.52%(P<0.05), Pro含量较其未胁迫组分别增加了438.55%、323.64%和356.36%(P<0.05)，SP和SS含量为G4>G3>CK，Pro含量为G3>G4>CK，此胁迫时间下的G3和G4的3种渗透调节物质均高于CK，说明一定高温胁迫可增加苜蓿分化苗的SP、SS和Pro。

2.3 辐射和高温胁迫对苜蓿分化苗膜脂透性的影响

MDA含量和RC高低可以反映植物遭受逆境伤害的程度。高温对苜蓿分化苗MDA含量和RC影响见图4，3组苜蓿分化苗的MDA含量和RC均随高温胁迫时间延长呈增加的趋势，在高温胁迫4 d达到最大值。G3和G4分化苗在未高温胁迫下的MDA含量分别为CK的1.07倍和1.19倍，RC为CK的91%和98%，说明一定辐射剂量可增加膜脂氧化和膜透性。

图4 辐射和高温胁迫下苜蓿分化苗MDA含量和RC的变化

在40℃高温胁迫4 d时，CK、G3和G4分化苗的MDA含量较其未胁迫组分别增加了80.86%，36.53%和61.08%(P<0.05), RC较其未胁迫组分别增加了23.75%、25.66%和21.55%(P<0.05), MDA含量为G4>CK>G3，RC含量为CK>G4>G3，表明一定的辐射剂量可以缓解高温胁迫对苜蓿分化苗细胞膜的损伤。

2.4 辐射和高温胁迫对苜蓿分化苗抗氧化酶活性的影响

逆境胁迫下抗氧化酶活性高低与植物抗逆性密切相关。高温对苜蓿分化苗POD和SOD活性的影响见图5，3组苜蓿分化苗(CK，G3，G4)POD和SOD活性均随胁迫时间延长呈先增后降趋势，在40℃高温胁迫下，CK，G3和G4分化苗POD和SOD活性在高温胁迫2 d或3 d达最大值。G3和G4分化苗在未高温胁迫下，POD活性分别为CK的1.19倍和1.68倍，SOD活性分别为CK的56%和82%，辐射苜蓿分化苗的POD和SOD活性均高于未辐射苗。在40℃高温胁迫3 d时，CK、G3和G4分化苗的POD活性较其未胁迫组分别增加了59.58%、82.87%和130.52%(P<0.05)，SOD活性较其未胁迫组分别增加了114.28%、350.91%和160.00%(P<0.05), 3组分化苗的各胁迫组POD活性为G4>G3>CK，SOD活性变化不一，但一定的辐射剂量可增加苜蓿分化苗的POD和SOD活性。

辐射和高温对苜蓿分化苗CAT活性的影响见图5，高温处理3组苜蓿分化苗(CK，G3，G4)CAT活性均随胁迫时间的增加呈降低的变化趋势，在高温胁迫4 d达最小值。G3和G4分化苗在未高温胁迫下，G3和G4分化苗的CAT活性分别为CK的89%和82%；高温胁迫4 d时，CK、G3和G4分化苗的CAT活性较其未胁迫组增降低了81.68%、65.57%和69.58%(P<0.05)，3组分化苗各胁迫组的CAT活性变化不一致，高温胁迫降低了CAT活性，但一定的辐射剂量可增加苜蓿分化苗CAT活性。

图5 辐射和高温胁迫下苜蓿分化苗抗氧化酶活性的变化

2.5 高温胁迫苜蓿分化苗耐热系数

耐热系数的变化反映了植物在面对高温环境时的耐热能力，3组分化苗耐热系数的变化值见表1。与CK相比，高温胁迫不同时间后的苜蓿分化苗各指标耐热系数均发生不同程度改变，SP、SS、Pro、POD和SOD这5项指标呈先升后降现象，CAT指标呈下降，而MDA和RC呈升高趋势，表明高温胁迫下苜蓿可通过植株自身的生理响应来抵抗逆境。依据3种苜蓿分化苗各单项指标耐热系数的变化幅度，得出各单项指标对高温胁迫的敏感程度，结果为SP>Pro>SS>POD>SOD>MDA>RC>CAT，表明苜蓿的SP和Pro对高温胁迫的敏感性较大，CAT较小。

表1 苜蓿分化苗耐热系数

2.6 高温胁迫苜蓿分化苗抗性综合分析

采用隶属函数法和综合D值法，对3组苜蓿分化苗在高温胁迫下的生理生化指标变化进行综合评价(表2)。CK，G3和G4分化苗各项指标的隶属函数平均值分别为0.168，0.700和0.668，各项指标的综合D值分别为0.219，0.694和0.669，3组分化苗的抗性综合评价由大到小依次为G3>G4>CK，辐射可提高苜蓿分化苗的耐热能力，其中G3分化苗抗性最高。

表2 苜蓿分化苗8项指标的隶属函数值

3 讨 论

植物在生长发育过程中难免遭遇各种逆境胁迫，随着全球气候变暖，极端温度日益增加，对植物生长发育造成不利影响。培育抗逆境胁迫牧草品种是牧草抗逆育种研究的重要方向。组织培养技术结合辐射诱变进行育种，可增加后代选择机会，缩短牧草育种周期[15]，从植物细胞中筛选出抗逆境强的突变体，现已成为植物品种改良和新品种选育的新途径。对于辐射后代苜蓿愈伤组织分化苗而言，研究高温胁迫下分化苗生理生化指标的变化，有助于了解辐射和高温双重作用后苜蓿分化苗的生理损伤机制。

为适应复杂多变的环境，植物在渗透调节物质上发生与之相应的改变来适应环境，一定辐射剂量和高温逆境胁迫下植物叶片可积累SP、SS和 Pro等渗透调节物质，通过提高细胞渗透压来维持细胞的持水力和水分代谢平衡[16-17]，减轻辐射和高温胁迫对植物的伤害。已有研究表明，辐射处理多花野牡丹(MelastomaaffineL.)种子幼苗SP和SS随着辐射剂量的增加呈先升后降的趋势[18]，高温胁迫导致羊栖菜(SargassumfusiformeO.)细胞内积累了SP、SS和Pro等渗透调节物质[19]，说明在适宜辐射剂量和高温下依然可以维持一定的正常代谢，这与本研究中所筛选的获得辐射的G3和G4苜蓿分化苗和高温胁迫苜蓿分化苗积累更多的3种调节物质的研究结果一致，且辐射可促进高温胁迫的G3和G4分化苗SS、SP和Pro的积累，与韩亚楠[20]研究60Co-γ辐射对盐胁迫下乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralensisF.)耐盐性的影响中合成脯氨酸方式减少离子毒害的研究结果相似。

辐射和高温超过植物的耐受能力后，会使其膜系统受到伤害，电解质从细胞内渗出，引起组织浸出液电解质浓度增加，反映在相对电导率升高、植物膜系统受损，还可造成膜脂过氧化，MDA是膜脂过氧化作用的产物[21]，其含量增加是膜脂过氧化的表现，因此RC和MDA含量高低可衡量细胞膜损伤程度，与植物的抗逆性呈负相关。张秀梅等[22]通过60Co-γ辐射对洋竹草(CallisiarepensJacqL.)生理影响的研究表明，辐射提高了各处理MDA含量和RC，MDA含量及RC呈不断升高的趋势，且在 38℃高温胁迫 15 d 时达到最大值，这与本研究中所获得的辐射G3和G4苜蓿分化苗和高温胁迫苜蓿分化苗的MDA和 RC的增加研究结果一致，且辐射和高温双重作用下，G3和G4分化苗的MDA和 RC增加。郑凤霞[23]研究低剂量60Co-γ辐照对拟南芥幼苗耐热性的影响，在40℃ 6 h热胁迫下，50 Gy60Co-γ辐射的拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)幼苗中MDA明显低于CK，进一步证明低剂量的60Co-γ辐射能够减轻热胁迫对植物造成的损伤，与本研究中800 Gy辐射剂量下的高温胁迫可降低对苜蓿分化苗的细胞膜氧化损伤研究结果一致。

POD、SOD和CAT是植物细胞内清除活性氧的重要保护酶，在辐射和高温一定限度内，保护酶可诱导生理反应，使植物避免活性氧自由基对自身的伤害[23-24]。已有研究表明，60Co-γ射线对露地菊(Dendranthema×grandifloraGround-growChrysanthemum)品种辐射诱变效应[25]中，SOD和CAT活性呈现先升后降的趋势，POD活性随辐射剂量增加呈现出上升的趋势，高温胁迫对丝瓜(LuffacylindricaR.)幼苗抗氧化酶活性研究中[26]，随高温胁迫时间的延长，SOD、POD和CAT活性均呈先升后降的趋势，SOD和POD活性均在胁迫3 d时达到峰值，CAT活性在胁迫1 d时达到峰值，本试验中高温使苜蓿分化苗正常的氧代谢受到干扰，逆境初期POD 和SOD活性升高，表现为保护效应CAT 降低，随着胁迫时间的延长，POD、CAT和SOD活性逐渐降低，使自由基积累和MDA 含量显著增加，细胞膜系统损伤，加重了苜蓿分化苗伤害。郑凤霞[23]研究低剂量60Co-γ辐照对拟南芥幼苗耐热性的影响，在40℃、6 d热胁迫下50 Gy60Co-γ辐射的拟南芥幼苗中SOD、POD和CAT的活性明显高于CK，表明了低剂量的60Co-γ辐射能够增强植物的抗氧化酶活性，与本研究中一定辐射剂量苜蓿分化苗在40℃、4 d热胁迫下SOD和POD的活性变化结果一致，而与CAT的活性变化存在差异。

4 结 论

对苜蓿分化苗进行高温胁迫和分化苗存活率及生理生化指标变化分析，综合评价辐射分化苗对高温胁迫抗性。依据高温对苜蓿分化苗存活率影响，确定模拟高温胁迫进程为40℃、4 d；高温胁迫对CK、G3和G4分化苗的渗透调节物质、膜脂透性和抗氧化酶活性产生不同影响。对8项生理生化指标的综合分析表明，G4平均隶属函数值和综合D值最高，分别为0.793和0.852，3组分化苗耐高温能力排序为G4>G3>CK，说明一定辐射剂量可以提高苜蓿分化苗的抗性。