油莎豆抗旱基因CeDREB2.1的克隆与功能分析

柴乖强，秦媛媛，康雨欣，黄 凡，段义忠，亢福仁

(1. 榆林学院生命科学学院，陕西 榆林 719000；2. 陕西省陕北矿区生态修复重点实验室，陕西 榆林 719000)

随着全球气候逐年变暖，越来越多的植物正遭受着干旱、高热、高盐等非生物逆境胁迫[1]。非生物胁迫可引发植物体多种形态生理变化，如叶片萎蔫、叶片脱落、相对含水量(RWC)降低、叶绿素含量和膜稳定性降低、电解质渗漏增加和活性氧(ROS)的产生等[2-3]。植物在受到逆境胁迫时，从周围环境感知信号并适当地通过调节相关基因的表达，建立相应的防御机制[4]。转录因子能够结合到特定顺式作用元件，激活并调节下游大量基因表达，进而增强了植物对胁迫环境的耐受性。一般来说，植物的抗旱性是由多个基因调控的复杂性状，单个抗旱基因在植物抗旱过程中所起的作用比较有限[5]，而利用转录因子调控其下游抗旱相关功能基因来提高植物抗旱性已经是目前研究的热点之一[6-7]。到目前为止，在植物中已经发现了许多重要的抗旱性基因。其中，干旱响应元件结合蛋白(Dehydration responsive element binding protein，DREB)家族存在于多种植物中，并在增强植物对各种非生物胁迫(包括干旱胁迫)的耐受性方面发挥着重要作用，DREB可以特异性地与启动子中的DREB/CRT顺式作用元件结合，激活逆境相关基因的表达，提高作物的抗性[8]。

研究发现，DREB转录因子广泛参与调控生物和非生物胁迫应答以及ABA响应敏感性等各种反应。其中利用DREB2亚家族转录因子改良植物抗逆性也取得理想的效果。比如在模式作物水稻中过量表达OsDREB2A和OsDREB2B能显著增强水稻对干旱、盐碱和高温环境的耐受性[9]。

油莎豆(Cyperusesculentus)又名虎坚果、油莎草、洋地栗和铁荸荠等[10]，原产地是非洲尼罗河沿岸地区。油莎豆是一年生的块茎类植物，属于莎草科莎草属[11]。油莎豆营养丰富，是一种优质、高产、综合利用价值高的油、粮、饲、药多用新型经济作物，产量远高于其他油料作物，号称“油料之王”。油莎豆具有较强的抗旱、耐瘠、耐盐碱等特性，其对生长条件的要求不严格，甚至可以在沙漠荒地、盐碱地和滩涂地上生长，因此成为研究植物抗逆性的理想材料。当前，国内外关于油莎豆的研究主要集中在栽培技术、营养品质分析、加工工艺、转录组测序及生物信息学分析等方面[12-13]。研究挖掘油莎豆耐逆相关基因，可以为今后培育植物抗旱种质提供新的基因资源。

目前油莎豆DREB转录因子的调控网络和潜在的作用机理还不明晰，因此本研究基于课题组前期建立的油莎豆叶片转录组数据库，并在分析DREB转录因子结构的基础上，拟采用PCR扩增、生物信息分析、超表达载体构建和非生物胁迫诱导表达分析等方法，初步探究油莎豆CeDREB2.1的生物学功能，以期为解析CeDREB2.1参与抗逆的分子机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油莎豆品种‘榆引-1’(图1，见15页)，该品种茎叶丛生，分蘖能力极强，植株高度80～100 cm，生育期为150 d左右，根系发达，地下可形成块茎，一般每蔸可结块茎100～200粒，平均产量500～600 kg·667m-2。由陕西省陕北矿区生态修复重点实验室种植并保存。

图1 油莎豆材料‘榆引-1’

1.2 研究方法

1.2.1 油莎豆叶片总RNA的提取和cDNA的合成 将生长至有6～8片叶子的油莎豆幼苗进行干旱胁迫处理10 d，干旱胁迫后采取油莎豆幼嫩叶片，放置于液氮中，采用国产君诺德RNA(型号2117A,武汉君诺德生物科技有限公司)提取试剂盒，提取出油莎豆叶片总RNA，并使用反转录试剂盒合成cDNA，-20℃保存[14]。

1.2.2 油莎豆CeDREB2.1的克隆 根据课题组前期建立的油莎豆转录组数据库，从中挖掘出在干旱胁迫下表达量高的一条DREB序列，命名为CeDREB2.1，并依据开放阅读框设计特异引物F1:AATTTTGCGGACATGGGTGCTTA和R1: CAGTCATTCCGTTCTTGCGTTCC。以cDNA为模板，扩增CeDREB2.1基因，扩增体系为25 μL：(2×Pfu Mix 12.5 μL，dNTP 2 μL，引物F、R各1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 8 μL)。PCR反应程序为：(预变性94℃ 3 min,94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，35循环；72℃ 10 min)，产物经1.0的琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的片段。胶回收后的目标片段末端加A后，连接到EZ-T克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α细胞，在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养筛选出阳性克隆，并通过菌落PCR鉴定阳性克隆。最后挑选阳性克隆菌液，送至上海生物工程有限公司进行测序，挑出正确的CeDREB2.1基因序列。

1.2.3 油莎豆CeDREB2.1的生物信息学分析 分别通过ProtScale analysis(https://web.expasy.org/)、NPS-Prabi(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)、SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive)在线分析软件对CeDREB2.1的亲疏水性、二级结构和三级结构进行预测。同时分别运用DNAMAN和MEGA7.0分析CeDREB2.1的保守结构域和物种亲缘关系。

1.2.4 植物遗传表达载体的构建和农杆菌介导的遗传转化 利用高保真酶从测序成功的质粒上扩增CeDREB2.1目标片段，并对产物进行末端加A处理；同时，使用XcmⅠ对植物表达载体pCXSN进行酶切，回收酶切后的大片段，使用T4连接酶将CeDREB2.1目标片段与酶切回收的pCXSN进行连接[15]，连接产物转化Top10感受态细胞，在含有卡那霉素的LB固体培养基上培养筛选出阳性克隆，并通过菌落PCR筛选阳性克隆。最后挑选阳性克隆菌液，送至上海生物工程有限公司进行测序。农杆菌介导的拟南芥遗传转化试验采用浸花法进行[15]。采用潮霉素平板对转基因拟南芥T1和T2代种子进行筛选，获得转CeDREB2.1的纯合株系，在T3代进行干旱胁迫处理，处理方法如下[4]：将T3代种子播于营养基质中，放于光照培养箱中(14 h/10 h光周期，光照强度8 000 Lx，温度22℃，相对湿度50%～55%)生长约4周，再进行控水10 d处理，待大多数叶片萎蔫并开始变黄时，进行复水处理14 d。最后统计转基因株系和对照的成活率。每个处理重复3次，每个重复选用16株转基因植株。

1.2.5 油莎豆CeDREB2.1在转基因拟南芥中的半定量表达分析 野生型Col-2和转CeDREB2.1基因拟南芥叶片RNA的抽提采用国产君诺德RNA提取试剂盒进行，提取出拟南芥叶片总RNA后，使用反转录试剂盒合成cDNA，-20℃保存备用。以拟南芥AtACTIN基因为内参，以上述转基因拟南芥cDNA为模板，用Taq聚合酶进行扩增，反应体系(20 μL)为：Mix-Taq buffer(2×) 10 μL，引物F和R (10 pmol·μL-1)各1 μL，cDNA(10 ng·μL-1) 0.5 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR反应程序参数为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃，40 s，循环数为30；72℃ 10 min，4℃永久保存。根据电泳结果，调整样品cDNA的浓度，继续完成PCR扩增，直至内参AtACTIN的电泳条带亮暗完全一致时，以调整后的拟南芥cDNA为模板，用引物RT-CeDREB2.1(表1)进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测[16]，并照相保存。

1.2.6 油莎豆中CeDREB2.1的表达分析 选取约180粒饱满的油莎豆种子，采用体积浓度10%的NaClO消毒后，播种于含有营养基质的花盆中，放置于科研温室，正常浇水。待生长至5叶期后，将油莎豆幼苗从基质土中轻轻取出，清洗掉根上的基质土，进行逆境胁迫处理。对于干旱处理：取30株幼苗，每10株为一个生物学重复，用漂浮板固定好，将其漂浮在含有10%的PEG6000溶液中处理24 h；高温和低温处理：分别取30株油莎豆幼苗，将其漂浮在无菌水中，分别放置于42℃培养箱和4℃春化培养箱处理24 h；对于盐胁迫和ABA处理：分别取30株油莎豆幼苗，用漂浮板固定好，将其漂浮在含有300 mM的NaCl和100 μM的ABA溶液中处理24 h；对照用无菌水处理24 h[17]。处理完成后，剪取叶片，用干净的铝箔纸包好，液氮速冻。每个处理取3个生物学重复。样品RNA的抽提采用国产君诺德RNA提取试剂盒进行，提取出油莎豆叶片总RNA后，使用反转录试剂盒合成cDNA，-20℃保存备用[10]。

选取油莎豆CsACTIN为内参，以相应的cDNA为模板，选用TaKaRa的SYBR® Premix Ex TaqTM II试剂盒，采用CFX96TM Real-Time PCR Detection System，进行qRT-PCR表达量分析(表1)。qPCR反应体系总体积为25.0 μL：cDNA(10 ng·μL-1)0.5 μL，SYBR® Premix Ex Taq(2×) 12.5 μL，引物F和R (10 pmol·μL-1)各1 μL，ddH2O 10 μL。qRT-PCR反应条件：95℃预变性30 s；95℃ 变性15 s，54℃退火30 s，65℃延伸10 s，共40个循环。每个处理设3个生物学重复。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

表1 基因表达分析所使用的引物

1.3 数据处理

数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，采用SigmaPlot 12.5完成作图。

2 结果与分析

2.1 油莎豆CeDREB2.1基因克隆

使用Tiagen TrizolRNA提取试剂盒提取油莎豆叶片总RNA，检测RNA提取结果(图2A)，3条条带清晰明亮，说明RNA纯度较高，可以进行后续的实验。再用反转录试剂盒，将总RNA反转录成cDNA，并以稀释6倍的cDNA为模板进行PCR扩增，得到一条长度约为1 200 bp的条带(图2 B)，条带大小与预期相一致。

将扩增产物连接到EZ-T测序载体上，热激法转化大肠杆菌DH5α，转化后取50μL均匀涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，培养8～12 h，挑取单克隆菌落，利用菌液PCR筛选阳性克隆(图2C)，选取3个阳性克隆送至上海生物工程有限公司测序检测。测序成功后，将序列提交到NCBI数据库中(登录号为：MZ713253)，并将此基因命名为CeDREB2.1，其开放阅读框长度为1 191 bp，编码397个氨基酸。

注：A. 油莎豆叶片总RNA的检测;B. CeDREB2.1的扩增PCR;C.连接测序载体后筛选阳性克隆。

2.2 油莎豆CeDREB2.1的生物信息学分析

利用ProtScale analysis软件分析蛋白亲疏水性，结果表明，CeDREB2.1编码的多肽链中异亮氨酸(Ile)具有最高的分值4.500，疏水性最强；精氨酸(Arg)具有最低的分值-4.500，赖氨酸(Lys)分值为-3.900，该氨基酸序列内含有较多的亲水区域(图3 A)，表明油莎豆CeDREB2.1编码为亲水性蛋白。

使用ProtParam在线软件分析，得出CeDREB2.1蛋白质的分子式为C1872H2873N537O647S17，分子量为43.80 kDa，理论等电点为4.67，编码20种氨基酸，其中丝氨酸(Ser)含量最高(10.9%)。二级结构中，α螺旋(h)、延伸链(e)、β折叠(t)和无规卷曲(c)分别占26.01%、6.57%、2.78%和64.65%，可见无规卷曲和α螺旋是CeDREB2.1的大量结构元件(图3 B)。CeDREB2.1三级结构预测分析表明，其与二级结构预测相似(图3C)。

图3 油莎豆CeDREB2.1的结构分析

同时通过在线软件，对油莎豆CeDREB2.1的结构域进行分析，结果表明此蛋白有一个AP2/ERFBP结构域(图4A，见17页)，前人研究表明含有AP2结构域的蛋白广泛存在于植物中，该结构域通常依赖于ABA、JA、SA和乙烯等激素来调控下游基因的表达，进而增强植物的抗逆能力[18-19]。将CeDREB2.1与已知生物学功能的其他植物如小麦、胡杨、杨树、大豆、马铃薯、玉米、水稻、拟南芥、谷子、高粱、苹果、向日葵等12个物种的DREB进行比对，发现莎豆CeDREB2.1与12个其他物种的DREB蛋白序列的相似性较高(图4B，见17页)。运用MEGA7.0软件中的邻接法(Neibor-Joining)算法构建系统进化树(图4C,见17页)，结果表明，油莎豆CeDREB2.1与胡杨(Populuseuphratica)、杨树(Populustrichocarpa)和苹果(Malusdomestica)的DREB蛋白的亲缘关系比较近。

图4 油莎豆CeDREB2.1保守结构域预测和在不同物种间的系统发育分析

2.3 油莎豆CeDREB2.1超表达载体的构建及功能验证

根据CeDREB2.1序列的长度和超表达载体序列，选择XcmⅠ进行单酶切pCSXN质粒(图5A)，片段大小为5 kbp，大小与预期相符，并将大片段切胶回收。同时，扩增CeDREB2.1基因并做末端加A处理，再利用T4连接酶将pCSXN与CeDREB2.1连接，转化大肠杆菌Top10，挑取单克隆并利用PCR筛选阳性克隆(图5 B)。提取阳性克隆的质粒，将pCXSN-CeDREB2.1重组质粒用XcmⅠ酶做单酶切鉴定，切出的小片段与CeDREB2.1基因大小一致(图5 C)，表明目的基因的超表达载体构建成功。

图5 油莎豆pCSXN-CeDREB2.1超表达载体的构建

接着，将超表达载体转入大肠杆菌GV3101中，利用农杆菌浸花法转化拟南芥，并采用潮霉素对T1、T2代转基因拟南芥种子进行筛选，同时结合PCR检测(图6B)，最终获得转CeDREB2.1基因植株，并在种植的T3代选择两个株系Line2和Line5，分别种植48株进行抗旱处理，并通过统计成活率对其表现型进行分析，结果表明，转CeDREB2.1基因拟南芥株系在干旱10 d后并复水2周后，其成活率极显著高于野生型(图6A、6C)，说明CeDREB2.1在植物中具有抗旱的功能。

注：(A)转CeDREB2.1拟南芥在干旱处理下的表型鉴定；(B)干旱胁迫处理下CeDREB2.1在拟南芥中的表达分析；(C)干旱胁迫处理后，拟南芥成活率统计分析。柱形图上**表示数据间具有极显著差异(P<0.01)。

2.4 油莎豆CeDREB2.1在不同逆境胁迫下的表达分析

为了研究CeDREB2.1基因在不同非生物胁迫下的表达差异，分别用10% PEG6000干旱模拟、300 mmol·L-1的NaCl盐胁迫，100 μmol·L-1的ABA处理，高温(42℃)和低温(4℃)5种胁迫处理油莎豆幼苗24 h。分别采集胁迫处理后的油莎豆叶片提取出RNA，并反转录成cDNA后应用半定量RT-PCR和荧光定量PCR检测CeDREB2.1在油莎豆中的表达量。RT-PCR结果表明，CeDREB2.1能够被不同类型的胁迫诱导表达，诱导表达程度存在一定差异(图7 A)，在干旱、低温、高温和盐胁迫条件下，CeDREB2.1基因的表达量要高于ABA激素处理。荧光定量PCR结果和RT-PCR结果相似(图7B)。说明CeDREB2.1基因参与油莎豆对多种非生物胁迫的响应过程。

3 讨 论

随着全球气候的逐年变化，干旱、热、冷、高盐等极端环境也随之频繁发生，这些极端环境造成的渗透胁迫直接影响植物生长发育和作物的产量[20]。为了应对不利的外界环境，植物在生长发育过程中逐渐进化出一系列复杂且有序的生理生化机制来感应环境变化、抵御环境带来的不利影响[21]。其中激活植物体内一些功能基因的表达，进而产生耐受性是对极端环境作出的响应之一[22]。目前为止，已经有很多基因和信号途径参与了植物对逆境的调控，如NAC[23]、DREB[24]、MYB[25]、WRKY[26]、bZIP[27]等，其中DREB蛋白家族作为AP2/ERF亚家族之一，属于植物适应逆境的关键调节因子，在调控非生物和生物胁迫反应中的发挥着重要作用，近年来受到了广泛的关注和研究[28]。

研究表明，植物界中的DREB蛋白主要分为6个亚家族(A1～A6)，目前已知的大多数DREB均属于A1和A2亚家族。其中拟南芥AtDREB1A/CBF3，属于A1亚家族，能够在冷胁迫下被诱导表达。DREB2A和DREB2B属于A2亚家族，研究表明，这两类基因能够被干旱胁迫、热胁迫、盐胁迫、ABA等多种因素诱导表达，因此是比较重要的一类亚家族[4,29]。本实验中，我们根据课题组前期建立的油莎豆转录组数据库，从中挖掘出在干旱胁迫下表达量高的一条DREB序列，通过PCR扩增，从油莎豆叶片中克隆到一个DREB基因，命名为CeDREB2.1，通过同源序列比对，发现CeDREB2.1与其他物种中的DREB2具有较高的相似性，因此其属于DREB家族中的A2亚家族。

植物的耐逆性是多个基因共同作用的结果，为了提高植物的抗旱性，可以选择将抗旱相关的转录因子导入植物体内，获得过量表达的植株，最终应用于生产。转基因植物之所以能表现出较好的特性，是因为当植物受到胁迫时，这些应激反应基因表达上调，应激相关蛋白随后与下游的靶蛋白相互作用，以减缓植物体内活性氧的积累，维持细胞内稳态，最终增强植物对不利环境的耐受性[30]。其中，在DREB基因的应用方面，已经有许多抗旱基因被克隆出来，并且通过转基因过表达、转基因敲除或编辑技术，一部分基因的生物学功能已经明晰。在水稻中分别过表达OsDREB2A和OsDREB2B，转基因植株在水分极度亏缺和高盐胁迫下均表现出很高的存活率[31]。Zhou 等[32]将大豆GmDREB1转入小麦中，不仅提高了小麦的产量，而且在干旱条件下小麦的各种生理状态均显著优于对照，说明GmDREB1能增强作物的抗旱性。综上，笔者推测从油莎豆中克隆的CeDREB2.1基因也可能参与调控油莎豆抵抗干旱、高温、高盐等非生物胁迫过程，因此在本试验中，笔者成功地构建了CeDREB2.1的植物表达载体，并通过农杆菌浸花法将其转入拟南芥中，获得了T3代转CeDREB2.1的纯合株系，并通过干旱胁迫处理，发现转CeDREB2.1的拟南芥植株具有较好的抗干旱能力，初步验证了CeDREB2.1的生物学功能。

植物体内一些DREB2对外界不同胁迫会作出迅速的响应，如构树BpDREB2对干旱和高盐胁迫能作出较快的响应，在干旱条件下，BpDREB2的表达量在1～24 h间呈现先增高后降低的趋势，并且在6 h时达到最大值。但是在外源激素ABA处理条件下，其表达量很低，说明构树BpDREB2是不依赖于ABA的转录因子[33]。本研究对油莎豆CeDREB2.1在不同生物胁迫下的表达量进行了分析，结果表明CeDREB2.1对干旱、低温、高温、高盐和ABA均能作出响应，说明CeDREB2.1是一种依赖于激素ABA的转录因子，这与Li等[34]的结论相似，而与Cortés等[35]研究的结论不同，这可能是与植物体内的可变剪接所引起的核酸多样性有关。综上所述，本研究从油莎豆中克隆出一个CeDREB2.1基因，为进一步研究油莎豆抗旱特性，并且从分子水平上验证其生物学功能和抗旱新品种培育提供了新的思路。

共同第一作者贡献说明：柴乖强博士和秦媛媛硕士共同完成了本实验的实施和论文写作等过程。其中柴乖强博士主要完成基因的克隆、表达分析、表达载体的构建和拟南芥的遗传转化工作；秦媛媛硕士主要完成了转基因拟南芥后代植株纯合株系的筛选与种植、抗旱性鉴定等工作。