不同种源华重楼根茎生长性状表型变异和皂苷含量研究

周世水， 徐 梁， 江应钦， 韩素芳， 程诗明 ，成 亮，杨少宗， 柳丽娜

( 1.开化县林场， 浙江 开化 324300; 2.浙江省林业科学研究院， 浙江 杭州 310023； 3.开化县林业局， 浙江开化 324300； 4.安吉县林业技术推广中心， 浙江 安吉 313300)

华重楼(Parispolyphyllavar.chinensis)为百合科(Liliaceae)重楼属(Paris)多年生草本植物，在全国很多省都有分布，是《中华人民共和国药典》2020年版[1]收载的重楼药材中2种基原植物之一，属二级濒危物种，其药用价值突出，是著名中成药云南白药、官血宁胶囊、季德胜蛇药片、抗病毒颗粒等产品的主要原料[1-2]。据《浙江植物志》记载，华重楼在浙江省许多县市都有分布，是浙江省的珍贵野生药材资源[3]，也是浙江省林下经济发展主要种植的药材。目前，在测定重楼皂苷类成分的研究中，以测定宽瓣重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis)皂苷含量及其成分比较的研究较多[4-14]，此外，也有重楼属其他种之间皂苷含量比较的研究[19-24]，但有关华重楼皂苷成分的研究相对较少[15-18]。因此，本研究对9个不同种源的野生华重楼根茎生长性状和皂苷含量进行测定和分析，为其质量评价和种源选择提供参考。

1 试验区概况

试验地位于浙江省林业科学研究院白岩寺林区。该区地处天目山脉余脉，地理位置为119°59′51″—120°01′13″E，30°09′30″—30°10′23″N；气候温和，雨量充沛，全年平均气温16.5 ℃，极端高温39.8 ℃，极端低温-14.4 ℃，年平均湿度81%；森林覆盖率93%，海拔约102 m。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2018年5—9月，于浙江、江西、福建等地的林下采集9个种源华重楼野生植株，依据茎痕判定，华重楼植株均为7年生以上，均移栽于浙江省林业科学研究院白岩寺林区。于4—6月花期时进行鉴定，经杨少宗副研究员鉴定为华重楼，标本保存于浙江省林业科学研究院分析中心实验室。华重楼种源采集地具体信息见表1。

表1 华重楼种源采集地信息Tab.1 provenances information of Paris polyphylla var. chinensis samples 编号种源经度/°E纬度/°N海拔/m1浙江安吉119.64730.4715152浙江磐安120.53829.0219083浙江龙泉118.91328.0075234浙江龙游119.12628.8283835浙江淳安119.10829.8223446江西分宜114.68127.9503057福建连城116.90825.8306838福建宁化116.87226.3854449浙江遂昌119.04928.594535

2.2 仪器与试剂

(1)仪器。Waters Alliance E2695高效液相色谱仪(Waters 2996DAD检测器，美国Waters公司生产)；BSA1245万分之一电子天平(美国sartotius公司生产)；SB25-12DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司生产)；数显恒温水浴锅(HH-4，江苏环宇科学仪器厂生产)；DZF-0真空干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司生产)。

(2)试剂。对照品重楼皂苷Ⅰ(批号：50733-41-6)、重楼皂苷Ⅱ(批号：50773-42-7)、重楼皂苷Ⅵ(批号：55916-51-3)和重楼皂苷Ⅶ(批号：68124-04-9)均购于上海源叶生物科技有限公司，其中皂苷Ⅶ的纯度≥95%，其他皂苷的纯度均≥98%；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯，均购于杭州惠普生物科技有限公司；水为娃哈哈纯净水。

2.3 试验方法

2.3.1 根茎生长性状测量 2019年10月，在华重楼地上部分停止生长后，采集其地下根茎(以下简称根茎)，每个种源取4株，用直尺和游标卡尺测量主根、须根的长和直径，用电子天平测量根茎的鲜质量和干质量，数据保留2位小数。

2.3.2 根茎皂苷含量测定 将采集的华重楼根茎低温干燥后打粉过60目筛，应用HPLC法进行皂苷类成分的测定。色谱条件的确立、对照品和供试品溶液的制备、线性关系的考察、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、加样回收试验、样品测定的具体方法采用《中华人民共和国药典》2020年版[1]规定的方法。药材留样存放于浙江省林业科学研究院分析中心。

2.3.3 根茎折干率测定 将华重楼根茎用清水洗净，除净地上部分及须根，用吸水纸吸干表面水分后称鲜质量；然后放入60 ℃的烘箱烘干至恒质量。药材折干率=干质量÷鲜质量×100%。

2.4 数据处理

用Excel 2016软件处理初始数据；用SPSS 22.0软件进行表型变异、方差分析和相关性分析等。

3 结果与分析

3.1 不同种源华重楼根茎生长性状表型变异

从表2可知：华重楼种源主根长、主根直径、须根数、须根长、须根直径及根茎鲜质量、干质量、折干率的表型变异系数分别为0.137 0～0.405 1、0.080 2～0.325 2、0.100 4～0.429 7、0.101 9～0.605 8、0.147 9～0.393 1和0.190 4～0.726 2、0.260 5～0.741 0、0.053 7～0.196 7。说明种源间根茎生长性状的表型变异丰富，受遗传因素和环境因素的影响明显。种源间平均根茎折干率变化范围为28.20%～44.90%，折干率变化较大，9个种源平均折干率为36.72%。浙江淳安种源的平均根茎折干率最大，达到44.90%；浙江龙游种源的最小，只有28.20%。这些为选优提供了基础。

表2 不同种源华重楼根茎生长性状表型变异Tab.2 Growth phenotypic variation in provenances of Par-is polyphylla var. chinensis samples性状种源最小值最大值平均值标准差表型变异系数127.3667.5846.5318.8460.405 1232.9854.3040.509.8040.242 1358.00104.0078.2519.1550.244 8458.3479.5872.959.9970.137 0主根长/mm555.0077.0061.2510.5950.173 0658.0096.0079.0016.4320.208 0729.0647.6538.177.7680.203 5850.0095.0076.0020.3470.267 7945.0077.0066.7514.7960.221 7113.0228.3020.316.6030.325 2216.2022.9319.453.2830.168 8315.4034.0025.907.7540.299 4420.5027.5424.993.1240.125 0主根直径/mm517.5023.3020.602.5730.124 9624.2028.5026.502.1240.080 278.6014.6112.402.7360.220 7822.3030.0027.303.4240.125 4919.0027.0022.253.4030.153 01162720.254.7170.232 92113018.758.0570.429 73162722.504.6550.206 94233227.003.9160.145 0须根数根5142619.005.5980.294 66112416.256.0210.370 57152421.004.0820.194 48212523.002.3090.100 49142519.004.6900.246 9159.63214.79113.7468.900.605 8253.66222.69151.4875.2910.497 0388.14155.54135.7532.0070.235 84115.62148.53132.6513.5140.101 9须根长/mm5100.25199.07147.8149.0110.331 66133.14312.58206.3279.9390.387 5777.56133.35110.4723.5180.212 98131.13340.07232.55104.8520.450 99136.40311.19235.1675.4720.320 9

续表2 不同种源华重楼根茎生长性状表型变异Continued Tab.2 Growth phenotypic variation in provenances of Paris polyphylla var. chinensis samples性状种源最小值最大值平均值标准差表型变异系数10.892.451.650.6500.393 121.032.171.610.4840.300 330.450.680.550.0990.181 041.201.771.530.2480.162 3须根直径/mm50.340.780.540.1840.343 160.620.880.720.1190.165 170.901.851.430.3990.279 180.480.660.550.0810.147 990.450.730.570.1420.249 816.4732.2416.1311.7160.726 223.8417.3010.735.8550.545 538.5036.7026.9313.2350.491 5415.3027.2023.105.5650.241 0根茎鲜质量/g56.7021.4014.137.2130.510 7615.0038.1025.809.4720.367 172.117.645.732.4630.430 0814.7039.9029.4311.9260.405 3914.6023.1018.703.5600.190 411.8410.135.053.7440.741 020.966.964.052.5740.635 533.5515.3710.625.1570.485 544.248.406.551.8180.277 6根茎干质量/g53.648.435.952.3310.391 666.8815.3710.273.6220.352 770.922.852.170.8580.396 284.7816.3211.215.4450.485 794.468.616.671.7360.260 5128.4432.2330.841.6560.053 7225.0040.2335.286.9410.196 7336.5141.8839.892.5260.063 3426.4430.8828.201.8890.067 0根茎折干率/%534.6754.3344.908.0930.180 3635.4545.8740.364.2720.105 9735.4243.6038.803.4990.090 2832.5240.9036.933.8840.105 2930.5537.2735.263.1750.090 0

3.2 不同种源华重楼根茎生长性状差异性

表3方差分析结果表明：除须根数和须根长外，华重楼的其他根茎生长性状在种源间都存在极显著差异(P<0.01)，说明长期的地理隔离使其根茎生长性状在种源间已产生明显分化。这为进一步进行华重楼优良家系选择奠定了基础。

表3 不同种源华重楼根茎生长性状方差分析Tab.3 Anova on growth characters in provenances of Paris polyphylla var. chinensis samples变异来源平方和自由度均方F值P值主根长8 646.78681 080.8484.8790.001主根直径703.130887.8914.7600.001须根数311.500838.9381.4860.208须根长76 531.44389 566.4302.2860.052须根直径8.61181.07610.0790.000根茎鲜质量2 044.2868255.5363.3800.008根茎干质量315.209839.4013.4600.007根茎折干率823.1468102.8935.0870.001

3.3 华重楼根茎生长性状相关性

表4相关性分析结果表明：根茎鲜质量和干质量均与主根长、主根直径、须根数、须根长呈极显著正相关；鲜质量与须根直径呈显著负相关；干质量与须根直径呈极显著负相关。根茎鲜质量与主根直径的相关系数最大，达到0.911；与主根长的相关系数次之，为0.868。以上结果说明，华重楼的根茎鲜质量和干质量与其他性状间存在着显著相互影响的关系，根茎鲜质量和干质量随其他生长性状(除须根直径外)值的增大而增长。

表4 华重楼根茎生长性状相关系数Tab.4 Correlation among growth traits of Paris polyphylla var.chinensis samples主根长主根直径须根数须根长须根直径根茎鲜质量根茎干质量主根长1.000主根直径0.775**1.000须根数0.409*0.409*1.000须根长0.414*0.521**0.0641.000须根直径-0.451**-0.366*0.102-0.3041.000根茎鲜质量0.868**0.911**0.544**0.469**-0.345*1.000根茎干质量0.867**0.860**0.458**0.470**-0.428**0.969**1.000 注:* 表示在 0.05 水平(双侧)上显著相关;**表示 在 0.01 水平(双侧)上极显著相关。

3.4 不同种源华重楼皂苷含量

表5结果显示：不同种源华重楼中各种皂苷含量和总皂苷含量差异较大。除遂昌种源未检测出纤细薯蓣皂苷外，其他种源均检测出了7种皂苷。依据《中华人民共和国药典》2020年版[1]收载的重楼药材质量标准，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总含量>0.6%，只有安吉1个种源没有达到合格标准。龙泉种源的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ总含量最高，为1.252%；遂昌种源的其次，为1.158%；安吉种源的最低，仅为0.485%。磐安和淳安种源的重楼皂苷Ⅰ含量均最高；宁化种源的重楼皂苷Ⅱ含量最高；淳安种源的重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷H含量均最高；龙泉种源的重楼皂苷Ⅶ、纤细薯蓣皂苷含量均最高；磐安种源的偏诺皂苷含量最高。

表5 不同种源华重楼皂苷的含量Tab.5 Contents of polyphyllins in saponins collected from different provenances%种源重楼皂苷Ⅰ重楼皂苷Ⅱ重楼皂苷Ⅵ重楼皂苷Ⅶ偏诺皂苷重楼皂苷H纤细薯蓣皂苷重楼皂苷(Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ)总皂苷安吉0.0120.0170.0100.4460.4410.5300.0820.4851.538磐安0.0250.0300.0150.8001.9680.6410.3810.8693.860龙泉0.0120.0250.0101.2051.0840.5891.6631.2524.588龙游0.0120.0170.0070.5820.9550.6930.0940.6192.360淳安0.0250.0250.0170.7031.6390.8190.2720.7703.500分宜0.0200.0150.0070.7181.1390.6110.1210.7602.631龙岩0.0070.0250.0050.6780.1680.2770.0320.7151.192宁化0.0120.0350.0100.7130.4110.5000.0920.7701.773遂昌0.0120.0170.0051.1240.0720.168—1.1581.398

4 结论与讨论

不同种源华重楼根茎生长性状表型变异丰富，除须根数和须根长外，其他性状在种源间都存在极显著差异(P<0.01)，说明华重楼根茎生长性状受环境因素的影响极显著，这为其进一步的优良家系选择奠定了基础。华重楼根茎鲜质量和干质量均与主根长、主根直径、须根数、须根长呈极显著正相关；鲜质量与〗须根直径呈显著负相关；干质量与须根直径呈极显著负相关。根茎鲜质量与主根直径的相关系数最大，达到0.911；与主根长的相关系数次之，为0.868。这说明华重楼的根茎鲜质量和干质量与其他性状间存在着显著相互影响的关系。

9个种源华重楼的皂苷种类与含量有明显差异，其中龙泉种源的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ总含量最高，达1.252%；安吉种源的最低，仅为0.485%。除遂昌种源未检测出纤细薯蓣皂苷外，其他种源均检测出了7种皂苷，按照《中华人民共和国药典》2020年版[1]收载的重楼药材的质量标准，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总含量>0.6%，只有安吉1个种源没有达到合格标准。陈铁柱等[15]报道，21个产地的华重楼中，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总含量只有3个产地的达标到了合格标准；叶菲菲等[16]报道，来自7个产地的18个种源中，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总含量只有5个种源的未达到合格标准；周爱存等[17]报道，来自浙江不同采集地的华重楼，其种源间重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总含量存在显著差异，有1/2种源的未达到合格标准。本试验中，9个种源华重楼的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总含量合格率高，可能是因为采集的植株生长年限都在7年以上，说明重楼药材质量的影响因子除立地条件外，生长年限也是重要的影响因子。

重楼皂苷是华重楼的主要药效成分，其根茎生物量的高低直接影响药材产量，而中药材有效成分的积累和产量高低是一个非常复杂的过程，既受自身遗传因素的影响，也与气候条件、地理环境及栽培管理等密切相关。要获得高产稳产，筛选华重楼优质种源并进行规范化栽培的研究显得尤为重要。