深翻和秸秆还田对土壤微生物群落功能多样性的影响

张乃文，韩晓增，朴勇杰，蒋 锐，严 君，陈 旭，陆欣春，邹文秀，闫 雷

(1. 中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150081；2. 东北农业大学资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3. 北大荒集团八五二分公司农业技术推广中心，黑龙江 双鸭山 155100)

土壤中存在着大量的微生物群体，在土壤生态系统的能量流动及养分循环中扮演着重要的角色[1]，更重要的是，土壤微生物是反映土壤微环境变化的敏感性指标，其群落组成以及多样性对土壤生态系统的功能起着决定性作用[2]。土壤微生物群落功能多样性是反映土壤中微生物生态特征的指标，对了解微生物多样性提供可靠依据[3]。其中Biolog-Eco微平板法是根据土壤微生物对不同单一碳源利用能力的差异，表征土壤微生物代谢功能多样性，Biolog法最初被应用于菌种鉴定，1991年Garland和Mills首次将该方法用于微生物群落特征的研究，近二十几年来被广泛应用于微生物功能多样性的研究中[4]。这种方法具有操作简单，灵敏度高及分辨力强等优点，可以最大限度保留微生物群落原有的代谢特征，对揭示土壤微生物结构和功能多样性起着重要作用[5]。

土壤耕作方式的改变在影响土壤物理性质的同时，对土壤微生物群落也会产生影响。近年来，国内外学者利用土壤微生物来研究耕作方式对土壤生态系统的影响[6-7]。秸秆作为富含各种营养元素的农副产物，目前已被广泛应用于农业可持续发展中，有研究表明，秸秆还田不仅可以为土壤提供营养元素从而改善土壤理化性质，还可以对土壤微生物的群落以及功能产生影响[8]。土壤深翻也被视作保护性耕作措施之一，可以改变土壤物理结构，降低土壤容重，增加土壤通透性，增加土壤微生物量以及酶活性[9-11]。目前也有很多学者开展了对秸秆还田的研究，但对于不同秸秆还田方式对微生物的影响研究不够透彻，相对于传统耕作，免耕秸秆还田通过较少扰动增加土壤微生物的生物量[12]，但也有研究发现，免耕秸秆还田仅能增加表层几厘米处土壤养分含量以及各类群微生物数量及酶活性[13]，然而深翻还田能有效地打破犁底层，显著影响土壤理化性质，如提高土壤全效、速效养分含量，进而间接影响微生物群落结构，并且秸秆的输入使这种效果更加显著[14-15]。但是，深翻和秸秆还田对土壤微生物群落代谢功能多样性的影响缺少系统研究，并且其变化在不同土壤层次的差异尚不明确，同时关于秸秆深翻还田对土壤微生物群落代谢功能多样性影响的综合评价还鲜有报道。因此，本研究基于深翻和秸秆还田的田间对比试验，探讨其对不同土层土壤微生物群落功能多样性的影响，以期为建立合理的秸秆还田模式提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况与试验设计

试验始于2018年，在黑龙江省海伦市光荣村(47.21°N，126.50°E)进行，该地区属于典型温带大陆性季风气候，冬季寒冷干燥，夏季高温多雨，雨热同期，年平均气温1.5℃，年平均降水量约550 mm，降水主要集中在7—9月，无霜期约为125 d。土壤类型为中厚黑土。

试验共设置4个处理：常规耕作(CT，耕作深度15 cm，无秸秆还田)、秸秆浅混(SCT，耕作深度15 cm)、深翻(ST，耕作深度35 cm，无秸秆还田)、秸秆深混(SST，耕作深度35 cm)。SCT和SST的秸秆还田量均为10 000 kg·hm-2，秸秆粉碎至小于5 cm，均匀混合于相应深度土层中。试验采用完全随机区组设计，4个重复，所有小区均采用人工翻耕。小区面积为12 m2(4 m× 3 m)，于每年5 月播种玉米。施肥量：氮肥(N)180.0 kg·hm-2、磷肥(P2O5)70.0 kg·hm-2和钾肥(K2O)60.0 kg·hm-2。田间管理与当地相同。

1.2 样品采集与处理

于2020年10月5日采集每个处理0～15 cm和15～35 cm土层土壤样品，每个小区随机采集3个点的土壤样品，然后混合成一个样品，装在无菌袋中，迅速带回实验室。通过2 mm筛后放入4℃冰箱保存。

1.3 测定方法

1.3.1 土壤微生物功能多样性测定 试验采用Biolog-Eco微平板法测定，每个Biolog-Eco板上有96个小孔，设有3次重复，每个重复包含1个空白对照和31种单一碳源。利用烘干法测定土壤中含水率，通过含水率计算，称取相当于10 g烘干土的鲜土于装有90 ml灭菌的NaCl溶液(浓度为0.85%)中，210 r·min-1震荡30 min后静置20 min，然后取土壤上清液1 ml加入到9 ml NaCl溶液(0.85%)中，重复一次，最终制成稀释1 000倍的土壤稀释液；再用8通道加样器向Biolog-Eco板(BIOLOG，美国)加入150 μL土壤稀释液，于25℃下恒温避光培养，每隔24 h用BiologReader(BIOLOG，美国)读取590 nm和750 nm波长下吸光度数值，连续测定7 d[16]。

1.3.2 土壤理化指标测定 微生物量碳(MBC)和微生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法测定[17]。可溶性有机碳(DOC)用硫酸钾溶液提取，采用TOC-VCPH+TNM-1 总有机碳分析仪(SHIMADZU，日本)[18]测定。

1.4 数据分析

按照AIMEE等[19]方法计算：

平均颜色变化率(AWCD)：

AWCD=∑(Ci-R)/31

(1)

Shannon多样性指数(H)：

H=-∑Piln(Pi)

(2)

Simpson优势度指数(D)：

D=1-∑(Pi)2

(3)

Mclntosh均匀度指数(U)：

(4)

式中,Ci为各反应孔在590 nm的吸光值；R为Biolog-Eco板对照孔的吸光值；Ci-R<0.06时在计算中记为零；Pi为第i孔的相对吸光值与平板所有反应孔相对吸光值总和的比率；Ni为第i孔的相对吸光值。

使用Excel 2017整理试验数据，SPSS Statistics 22进行方差分析，采用Canoco 5.0软件进行主成分分析(Principal component analysis,PCA)，对微生物群落结构变化与环境因子构建结构方程模型(SEM)，SEM模型的构建和计算使用软件Amos v.24进行。采用Origin 2018作图。

2 结果与分析

2.1 深翻和秸秆还田对土壤微生物群落单孔平均颜色变化率的影响

连续7 d每隔24 h测得AWCD值见图1，不同处理AWCD随时间的延长而增加，土壤微生物在培养24 h内无显著代谢增长。从24 h到培养结束，所有处理下微生物的碳源代谢能力一直在增强，且在24～72 h内呈急速上升的趋势。在CT和SCT处理下土壤微生物碳源代谢利用能力在0～15 cm土层明显高于15～35 cm土层。总体上0～15 cm土层AWCD值表现为SCT>SST>CT>ST，而15～35 cm土层AWCD值表现为SST>ST>SCT>CT。

图1 土壤微生物群落平均颜色变化率(AWCD)随时间的变化

2.2 深翻和秸秆还田对土壤微生物群落功能多样性指数的影响

Shannon多样性指数(H)、Simpson优势度指数(D)和Mclntosh均匀度指数(U)等可以反映土壤微生物群落功能多样性。选取培养72 h进行土壤微生物群落功能多样性分析。从表1可以看出，不同处理Shannon指数和Simpson指数在0～15 cm和15～35 cm土层的差异不显著，在CT和SCT处理下Mclntosh指数在0～15 cm高于15～35 cm土层。其中0～15 cm土层Mclntosh指数表现为SCT>SST>CT>ST，且处理间差异显著。

表1 土壤微生物群落功能多样性指数

2.3 深翻和秸秆还田对土壤微生物碳源利用的影响

Biolog-Eco板上含有的31种碳源可以根据其化学基团的性质不同分为6大类。选取培养72 h进行碳源利用率分析。从图2中可以看出，在所有处理下土壤微生物对糖类、氨基酸类、多聚物类和羧酸类碳源的利用率均明显高于胺类和酚酸类，其中微生物群落利用的最高碳源为糖类，其次为氨基酸类。在0～15 cm土层中，SCT处理土壤微生物对糖类碳源的利用率最高，SST处理土壤微生物对氨基酸类碳源的利用率最高，ST处理土壤微生物对多聚物类和胺类碳源的利用率最高，CT处理土壤微生物对羧酸类碳源的利用率最高。在15～35 cm土层中，SCT处理土壤微生物对糖类、胺类和酚酸类，CT处理土壤微生物对氨基酸、多聚物类和羧酸类碳源的利用率最高。

注：1:糖类;2:氨基酸类;3:多聚物类;4:羧酸类;5:胺类;6:酚酸。

2.4 深翻和秸秆还田对土壤微生物群落碳源利用多样性的影响

对培养72 h的土壤微生物AWCD值进行主成分分析，结果见图3。选取前两个主成分，其贡献率分别为：33.37%和18.85%，累计贡献率为52.22%。从样品点的分布来看深翻和秸秆还田对土壤微生物群落碳源利用方式产生了显著影响，其中主要表现在秸秆的施用。在PCA1方向，0～15 cm土层的SCT和SST处理以及15～35 cm土层的SST处理与其他处理差异显著，这3种处理位于PCA1正端，而其他处理位于负端，且之间差异较小。在PCA2方向，0～15 cm和15～35 cm土层中SST和ST处理位于PCA2正端，0～15 cm土层的CT处理以及15～35 cm土层的CT和SCT处理位于PCA2负端，0～15 cm土层的SCT处理在正端和负端均有分布。

图3 深翻和秸秆还田下土壤微生物碳源利用的主成分分析

与PCA1 和PCA2 相关的31 种碳源信息见表2，其中与PCA1 贡献较大的碳源有糖类：D-葡萄胺酸、D-甘露醇、D-半乳糖醛酸、D-木糖、D-半乳糖内酯；氨基酸类：L-丝氨酸、L-精氨酸、L-苯基丙氨酸；羧酸类：丙酮酸甲脂；胺类：苯乙基胺。与PCA2 显著相关的碳源有糖类：N-乙酰基-D-葡糖胺；羧酸类：D-苹果酸。这些碳源因子使不同处理的土壤微生物群落功能多样性存在差异。

表2 31类碳源主成分矩阵

2.5 深翻和秸秆还田对土壤微生物群落功能特征变化的主要影响因子

对不同处理土壤理化因子(DOC、MBC和MBN)进行分析，结果见表3。同一土层各处理土壤之间存在显著差异。在0～15 cm土层，与CT相比，SCT和SST处理显著增加了土壤DOC、MBC和MBN含量。在15～35 cm土层，土壤DOC、MBC和MBN含量的变化趋势为SST>ST>SCT>CT，其中SCT和CT处理之间差异不显著；与CT相比，DOC、MBC和MBN含量在SST处理下分别显著增加了17.25%、50.00%和168.10%。

表3 深翻和秸秆还田下土壤的可溶性有机碳和微生物量碳氮/(mg·kg-1)

本研究采用SEM模型进一步揭示深翻和秸秆还田驱动土壤微生物群落功能多样性指数变化的直接或间接途径(图4)。SEM模型显示，深翻可以直接作用于Shannon指数、Simpson指数和Mclntosh指数，对土壤微生物群落功能多样性产生影响，深翻也可以通过改变土壤DOC含量间接影响土壤微生物群落Mclntosh指数。秸秆还田则是通过改变土壤化学性质间接影响土壤微生物群落功能多样性指数，并且秸秆还田对Mclntosh指数的变化产生了显著影响(标准化总效应为0.980)。

注：实箭头和虚线箭头分别表示正相关和负相关(P<0.05)。***表示P<0.001,**表示P<0.01,*表示P<0.05。箭头上的数字表示重要的标准化路径系数。χ2表示卡方拟合指数，R2表示模型解释的因变量方差。H：Shannon多样性指数；D：Simpson优势度指数；U：Mclntosh均匀度指数。

3 讨 论

大量研究证明深翻和秸秆还田会影响土壤微生物的群落结构及功能[20-21]。张常仁等[13]在研究中发现，秸秆还田能明显提高土壤磷脂脂肪酸、细菌、真菌和放线菌微生物生物量，提高土壤微生物多样性。与免耕相比，翻耕也可以提高土壤中各类群微生物数量与总微生物数量[22]。本研究采用Biolog-Eco生态板技术对深翻和秸秆还田下的微生物代谢活性进行分析，发现与常规耕作相比，秸秆浅混和秸秆深混处理显著提高0～15 cm土层的AWCD值，这与顾美英等[23]和孟超然等[24]的研究结果一致，其原因可能是秸秆混入土壤后，显著提高了土壤中N、P、K等养分和有机质含量，为微生物提供了充足的碳源和氮源，促进微生物生长和繁殖，同时也增强了土壤微生物群落利用碳源的能力，提高土壤微生物活性[25-26]。由于土壤的长期不合理耕作，如机械碾压等，导致了犁底层的存在[27]，限制了土壤中的水热传导和微生物活动。与常规耕作相比，深翻处理的土壤微生物AWCD值在15～35 cm土层显著提高，其原因可能是深翻打破了犁底层，改善了土壤结构，影响土壤养分积累，为微生物的生长繁殖提供了较适宜的土壤环境[28-29]。本研究还发现，在0～15 cm土层秸秆还田处理对AWCD的影响表现为秸秆浅混>秸秆深混，这是因为等量秸秆换入不同深度土层，而致使在同一土层秸秆的含量不同[14]。这与周东兴等[30]对不同秸秆还田量对微生物群落功能多样性影响的研究结果一致，大量的秸秆施入土壤，改善土壤理化性质及结构，从而促进土壤微生物的代谢活动[31]，但秸秆还田量过高和过低，也会影响秸秆降解微生物群落碳源代谢活性，对其产生不利影响。

通过对不同耕作措施下碳源代谢的多样性指数分析可以较准确地反映出土壤微生物群落功能多样性的变化[32]，虽然本研究中深翻及秸秆还田没有对Shannon指数和Simpson指数产生显著影响，但是与常规耕作相比，秸秆还田显著提高了Mclntosh指数。Li等[33]研究表明作物秸秆还田对Shannon指数、Simpson指数和Mclntosh指数等微生物功能多样性指数和碳源利用强度没有显著影响，罗希茜等[34]关于长期不同施肥对稻田土壤微生物群落功能多样性影响的研究中也有类似结果。关于Mclntosh指数，本研究与前人研究结果不一致，其原因可能是本研究秸秆还田的时间较短，并没有对土壤环境产生较大影响，而罗希茜等人是对长期秸秆还田下土壤进行分析；其次可能是因为本研究土壤的有机质含量较高，肥力较强[35]。另外，本研究发现深翻处理降低了0～15 cm土层的Mclntosh指数，可能是由于深翻过程中是亚耕层土壤与表层土壤充分混合的过程，导致深翻后 0～15 cm 土层土壤肥力减低限制了其他种微生物种群的生长代谢，致使群落均匀度下降[36]。

不同耕作措施下土壤微生物对单一碳源的相对利用程度存在相似性和差异性。本研究中土壤微生物代谢的最主要碳源是糖类、氨基酸类、多聚物类以及羧酸类，高晶晶等[37]对不同耕作措施下土壤微生物代谢特征的研究发现，秸秆深混处理下糖类、氨基酸类和羧酸类的利用率较高，本研究与其研究结果中可培养的优势菌群是一致的，刘晶鑫等[38]研究也有相同的结论。不同处理下微生物对6种碳源的利用率在0～15 cm和15～35 cm两个土层之间的差异不显著，而在不同处理间的差异显著。对31种碳源利用情况的主成分分析也显示，土壤微生物代谢功能在秸秆还田处理和未秸秆还田处理之间存在差异。这可能是因为秸秆的加入使土壤有机质含量和组份发生改变，韩晓增等[35]研究表明，秸秆还田在改善土壤物理结构的同时，也可以使土壤有机质含量和速效养分含量增加，本研究中秸秆处理下DOC、MBC和MBN含量增加也证明如此。也有研究[8，39]证明土壤微生物生物量、群落组成及其活性与土壤有机质含量及组成的关系密切相关，区余瑞等[40]研究发现微生物群落功能多样性与土壤有机碳及全氮含量相关。本研究发现，与常规处理相比，秸秆深混显著增加了土壤中DOC、MBC和MBN含量，MBC和MBN是固定在土壤微生物残体中的碳素和氮素，是植物生长可利用养分的重要来源，其含量的多少取决于土壤中微生物的含量[41]。卜洪震等[42]研究表明秸秆还田显著提高土壤中MBC含量，促使微生物活性增加，进一步影响微生物群落组成。SEM模型显示，DOC是调控土壤微生物群落结构和丰富度的变异首要因素，并且深翻和秸秆还田更多直接作用于微生物群落功能多样性指数，并非通过MBC及MBN等间接调节。

4 结 论

基于深翻和秸秆还田的田间试验研究发现，深翻和秸秆还田耕作下土壤微生物碳源利用率最高为糖类，其次为氨基酸类、多聚物类以及羧酸类。深翻提高了0～15 cm土层土壤微生物群落代谢功能的均匀度指数，且土壤微生物群落代谢功能多样性在有秸秆还田和未秸秆还田之间存在显著差异，可见秸秆还田会对土壤微生物群落功能的改善产生一定影响。另外，深翻和秸秆还田可以通过土壤养分的变化进而影响土壤微生物群落功能多样性。因此，本试验可为明确深翻及秸秆还田对不同土层土壤微生物群落功能多样性的影响以及提高土壤活力提供一定的理论依据。