超高效液相色谱-串联质谱法测定牧草中22种农药残留

谢 敏，张 静，王梦芝，周瑶敏，张大文，费 丹，赵立军*，徐 俊*

（1.江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，江西省农产品质量安全重点实验室，江西南昌 330200；2.四川省饲料工作总站，四川成都 610041；3.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009）

苜蓿因富含蛋白质和能量，素有“牧草之王”的美誉，是草食动物优质的饲草来源。在苜蓿种植过程中，病虫害较多，如褐斑病、锈病、花叶病、霜霉病；虫害多达10余种，包括蚜虫、草地螟、蓟马等（周春雷，2008；鲁鸿佩等，2008）。目前病虫害防治仍以喷施高效氯氰菊酯、吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪等农药为主（刘霞等，2019）。苜蓿每年收割2～5茬，有些种植户为预防病虫害的发生，常常加大农药剂量和喷施频率，进而导致苜蓿中农药残留问题。与此同时，苜蓿等牧草通过根系吸收土壤中累积的农药也会造成农药残留，通过饲喂进入动物体内，且因牛、羊等反刍动物牧草摄入量大，更易造成体内农药的慢性蓄积，导致动物组织和奶产品中出现农药残留，其中一些是国家违禁药物成分，会对人体健康造成危害。再加上我国每年进口苜蓿量很大，其质量安全在一定程度上影响我国畜产品的质量安全。

尽管目前国内外关于农药残留检测的报道较多（Lee等，2020；Viera等，2017；王峰恩等，2017），但针对牧草中农药残留检测的研究较少，已有报道要么数量较少（谷旭等，2021）要么种类单一（孙婷婷等，2021），难以满足现有检测需求。因此，进一步研究牧草中多种农药残留精准分析方法意义重大。当前，农药残留检测主要有液相色谱-质谱法（Chen等，2019）和气相色谱-质谱法（孙婷婷等，2021），而液相色谱-质谱法因其灵敏度高、选择性强等特点，已成为农药残留检测分析领域的主要方法。鉴于此，本研究以苜蓿为代表，通过乙腈提取，QuEchERS法净化，C18色谱柱分离，多反应监测模式测定，建立了牧草中22种农药残留的分析方法，以期为牧草质量安全监管及其农药残留风险评估提供科学依据，同时也为牧草的进出口检测提供了一种准确的定量分析方法。

1 试验方法

1.1 仪器和试剂 超高效液相色谱-串联质谱仪；N-EVAP112 氮吹仪；GL-88B型旋涡混合器。

甲胺磷、氧乐果、灭多威、噻虫嗪、3-羟基克百威、多菌灵、乐果、啶虫脒、磷铵、氯虫苯、烯酰吗啉、灭线磷、马拉硫磷、三唑磷、氯唑磷、苯醚甲环唑、氟虫腈砜、蝇毒磷、甲基异柳磷、水胺硫磷、甲拌磷、丙溴磷标准品；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（C18）、硫酸镁（MgSO4）、石墨化炭黑（GCB），试剂和溶剂均为分析试剂级或高效液相色谱级。

1.2 标准溶液配制 准确称取上述22种农药标准品，用乙腈分别配置成1000.0 mg/L的单标储备液，然后用乙腈分别稀释成质量浓度为10.0 mg/L的单标中间液，再用乙腈稀释制备成混合标准工作液，混合标准工作液中各农药质量浓度为1.0 mg/L，-20℃下避光储存备用。

1.3 UPLC-MS/MS条件

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm×1.8μm，美国 Agilent公司）；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵水溶液，B为乙腈；流速：0.3 mL/min；进样量：10μL；柱温：35℃；梯度洗脱程序为：0～4 min，B由2%线性变至80%；4～6 min，B由80%线性变至98%；6～8 min，B保持98%；8～9 min，B返回初始2%。

1.3.2 质谱条件 电离模式：电喷雾电离正负离子模式（ESI+和ESI-）；检测方式：多反应监测模式（MRM）；毛细管电压：3000 V；离子源温度：150℃；干燥气温度：150℃；干燥气流量：15 L/min；雾化气压力：30 psi；鞘气温度：300℃；鞘气流量：12 L/min；喷嘴电压：500 V（ESI+）和1000 V（ESI-）。各农药其他质谱参数见表 1。

表1 22种农药质谱参数

1.4 样品制备 样品切成1 cm长，冷冻干燥研磨成粉，干燥器封存。

1.5 样品前处理 准确称取1.00 g苜蓿样品于50 mL离心管中，加入10 mL饱和氯化钠溶液浸泡10 min，涡旋1 min。再加入20 mL乙腈，涡旋 1 min，超 声 15 min，4000 r/min 离 心 5 min，取5 mL上清液转移至盛有300 mg无水MgSO4、100 mg PSA、100 mg C18和 5 mg GCB 吸附剂的15 mL离心管中，涡旋 1 min，4000 r/min 下离心5 min。取1 mL上清液，加入1 mL纯水，涡旋混匀，过0.22μm水相微孔滤膜，待检。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法优化

2.1.1 提取剂选择 苜蓿干燥后含水量较低，提取前加水可加大样品分散度，增加比表面积，提升溶剂与样品接触面积，提取效果更佳（Lehotay等，2010）。且使用饱和氯化钠更有利于水与提取剂分层。因此，本方法选择在加提取溶剂前先加入饱和氯化钠溶液浸泡。

由图1可知，乙腈和1%乙酸乙腈效果最好，22种农药回收率均在65%～120%之间，其他2种提取溶剂效果不佳。考虑到含1%乙酸乙腈溶液会导致部分碱性农药分解，于是选择乙腈作为最终提取溶剂。

图1 不同溶剂提取回收率

2.1.2 净化方法优化 参考农药残留检测常用的 QuEChERS方法（Chen等，2019）、Florisil PR（王帅等，2021）和活性炭固相萃取柱（赵阿璇等，2021）等对苜蓿样品进行净化，结果如图2。

由图2可知，QuEChERS的综合回收率和提取效果较好，除3-羟基克百威、多菌灵、乐果、啶虫脒、磷铵的回收率超过120%，其他17种农药回收率范围均在80%～120%之间。

图2 不同净化方法回收率

2.2 基质效应、线性范围、检出限和定量限 采用纯溶剂和苜蓿基质分别配制标准曲线，以二者斜率计算基质效应（ME），发现22种农药均存在基质效应，除乐果基质增强效应外（402%），其余均存在基质抑制效应（-10%～-71%）。因此，试验采用空白样品溶液配制的系列混合标准溶液制作工作曲线降低了基质干扰。

采用空白基质加标配制质量溶度为0.5、1、2、5、10、20μg/L 的系列标准溶液，以浓度 - 峰面积绘制标准曲线，22种农药线性良好，R2均大于0.994。将标准溶液稀释至信噪比（S/N）为3和10的溶度分别定为化合物的检出限和定量限，结果如表2，22种农药的LODs为0.01～0.2μg/kg，LOQs为0.02～0.5μg/kg，符合多种农药残留分析要求。

2.3 回收率和精密度 采用空白样品中添加低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，每个浓度设6个平行，计算回收率和相对标准偏差（RSD），其结果如表2。方法回收率为73.7%～107.1%，RSD为0.7%～9.8%，满足农药的残留检测要求。谷旭等（2021）采用QuEChERS前处理结合液相色谱-串联质谱技术检测了苜蓿中乐果和甲基异柳磷等15种农药残留，回收率为76.7%～118.5%，相对标准偏差0.9%～19.3%。张立田等（2019）采用液相色谱串联质谱法测定青贮玉米中灭多威和3-羟基克百威等8种氨基甲酯类农药残留，回收率为70.83%～86.67%，相对标准偏差0%～8.15%。本研究结果与前人的研究结果相吻合，但本文检测的农药种类更多、灵敏度和精密度更高，是牧草农药残留检测方法的补充，在满足牧草样品检测要求的基础上具有更广泛的应用价值。

表2 基质效应，检出限和定量限及不同添加浓度的回收率和精密度（n=6）

3 结论

采用UPLC-MS/MS方法建立了同时检测牧草样品中22种农药残留的检测方法。该方法前处理简单，检测限和定量限更低，测定结果准确，能满足牧草样品中农药残留分析要求。