头孢氨苄聚合物分析方法优化

王新辉

（华北制药股份有限公司 倍达分厂，河北 石家庄 052165）

0 引言

头孢氨苄为第一代半合成头孢菌素，该药为口服制剂，是一种早期常见的抗生素，能抑制细胞壁的合成，主要用于敏感菌所致的呼吸道感染、尿路感染、皮肤软组织感染等的治疗。

研究证明，高分子杂质是β-内酰胺类抗生素的过敏源之一，β-内酰胺类抗生素单体分子在特定条件下能聚合形成高分子聚合物，而这些药物的过敏反应发生率与高分子聚合物的含量成正相关系，而非β-内酰胺类抗生素本身。因此对高分子聚合物的分析是质量控制的关键。

针对目前华北制药股份有限公司头孢氨苄聚合物原检测方法中主峰与其前相邻杂质峰不能做到基线分离，影响检验结果准确性的情况，对其检验方法中的条件进行优化并验证，通过方法的优化，为检测头孢氨苄聚合物的准确性提供可靠的依据。

1 检测方法

色谱条件：用TSK-GELG2000SWXL色谱柱，以[0.005 mol/LNaH2PO4溶 液-0.005 mol/LNa2HPO4溶液（39∶61） ]-乙腈（95∶5） 为流动相；流速为0.6 mL/min；检测波长为220 nm。

系统适用性要求供试品溶液色谱图中，头孢氨苄峰与相邻杂质峰间的分离度应＞1.5。

2 检测方法优化

2.1 流动相中有机相的比例优化实验

系统适用性溶液：取供试品溶液适量70 ℃水浴加热30 min。

2.1.1 流动相配制

分别选用磷酸盐缓冲液｛0.005 mol/L 磷酸氢二钠溶液-0.005 mol/L 磷酸二氢钠（61∶39）｝，与乙腈按不同比例（100∶0、95∶5、90∶10、85∶15）混合。

2.1.2 试验过程

取系统适用性溶液进样。

2.1.3 图谱

不同强溶剂比例条件下的系统适用性色谱图如图1 所示。

图1 不同强溶剂比例条件下的系统适用性色谱Fig.1 Chrogram of system opplicability under different strong solvent ratio

2.1.4 试验结果

随着有机相浓度的提高，主峰与前相邻峰的分离效果变差并且没有达到基线分离，100%浓度缓冲盐中主峰与前相邻峰之间疑似还有未完全分离的峰，而磷酸盐缓冲液∶乙腈=95∶5 的比例中主峰与前相邻峰分离较好，因此选择磷酸盐缓冲液∶乙腈=95∶5 作为流动相。

2.2 流动相pH 值的优化试验

2.2.1 流动相配制

磷酸盐缓冲液｛0.005 mol/L 磷酸氢二钠溶液-0.005 mol/L 磷酸二氢钠（61∶39）｝，磷酸盐缓冲液∶乙腈=95∶5，用磷酸和氢氧化钠调磷酸盐缓冲盐的pH 值为5.0、6.0、7.2、8.0。

2.2.2 试验过程

取系统适用性溶液进样。

2.2.3 图谱

不同缓冲液pH 值条件下的系统适用性色谱如图2 所示。

图2 不同缓冲液pH 值条件下的系统适用性色谱Fig.2 Chromatography of system applicability under different buffer pH value conditions

2.2.4 试验结果

头孢氨苄主峰前杂质峰与主峰的分离度随着磷酸盐缓冲盐的pH 值的增大而逐渐变差，其中pH=6.0 的分离较好，因此选择pH=6.0 的缓冲盐作为流动相A。

2.3 流速的优化

2.3.1 流动相配制

磷酸盐缓冲液｛0.005 mol/L 磷酸氢二钠溶液-0.005 mol/L 磷酸二氢钠（61∶39）｝，磷酸盐缓冲液∶乙腈=95∶5，pH=6.0，分别采用不同的流速为0.5、0.6、0.7 mL/min。

2.3.2 试验过程

取系统适用性溶液进样。

2.3.3 图谱

试验中不同流速条件下的系统适用性色谱如图3 所示。

图3 不同流速条件下的系统适用性色谱Fig.3 Chrogram of system applicability at different flow rates

2.3.4 试验结果

流速为0.5 mL/min 条件下的图谱主峰与前杂质峰的分离效果最佳。

2.4 不同浓度的磷酸盐缓冲盐优化

2.4.1 流动相配制

试验分别选用浓度为0.0025、0.005、0.01、0.05 mol/L 的磷酸盐缓冲液｛磷酸氢二钠溶液-磷酸二氢钠（61∶39）｝，磷酸盐缓冲液与乙腈混合（95∶5）。

2.4.2 试验过程

取系统适用性溶液进样。

2.4.3 图谱

不同缓冲盐浓度条件下的系统适用性色谱如图4 所示。

图4 不同缓冲盐浓度条件下的系统适用性色谱Fig.4 Chrogram of systematic applicability under different buffer salt concentrations

2.4.4 试验结果

分别对不同浓度的磷酸盐缓冲液进行了考察，结果显示，0.0025 与0.005 mol/L 缓冲盐浓度均可实现基线分离。因此，进一步对0.0025 和0.005 mol/L 的缓冲盐离子浓度进行试验选择。

2.5 筛 选

2.5.1 流动相配制

{磷酸氢二钠溶液-磷酸二氢钠（61∶39） 用磷酸调节pH=6.0｝：乙腈=95∶5,使用的磷酸盐缓冲液浓度为0.0025、0.005 mol/L。

2.5.2 试验过程

取系统适用性溶液、对照品溶液进样。

2.5.3 图谱

试验中不同浓度缓冲盐的系统适用性色谱如图5 所示。

图5 不同浓度缓冲盐的系统适用性色谱Fig.5 Chrogram of the systematic applicability of different concentrations of buffered salts

0.0025 mol/L 缓冲盐∶乙腈=95∶5 对照品溶 液色谱如图6 所示。

图6 0.0025 mol/L 缓冲盐∶乙腈=95∶5 对照品溶液色谱Fig.6 Chrogram of control solution of 0.0025 mol/L buffer salt∶acetonitrile=95∶5

0.005 mol/L 缓冲盐∶乙腈=95∶5 对照品溶液 色谱如图7 所示。

图7 0.005 mol/L 缓冲盐∶乙腈=95∶5 对照品溶液色谱Fig.7 Chrogram of control solution of 0.005 mol/L buffer salt∶acetonitrile=95∶5

2.5.4 试验结果

使用2 种不同缓冲盐浓度（0.0025 和0.005 mol/L） 配制的流动相得到的系统适用性溶液图谱的分离度均较好，主峰和主峰前杂质峰均能实现基线分离，但在缓冲盐浓度为0.0025 mol/L 的流动相系统下得到的对照品溶液图谱中头孢氨苄峰分叉，峰形异常。因此采用0.005 mol/L 的缓冲盐浓度为最终使用的缓冲液。

3 方法确定与方法验证

3.1 方法确定

色谱条件：色谱柱：TSK-GELG2000SWXL；流动相的配置：以[0.005 mol/LNaH2PO4溶液-0.005 mol/LNa2HPO4溶液（39∶61） 用磷酸调节pH 值至6.0]-乙腈（95∶5）。

流速：0.5 mL；

检测波长：220 nm。

系统适用性要求系统适用性溶液色谱图中，头孢氨苄峰与前相邻杂质峰间的分离度应＞1.5。

3.2 分析方法验证

3.2.1 检测限

配制低浓度的头孢氨苄标准溶液，调整此对照品溶液的浓度，以信噪比约3∶1 时的相应浓度作为检测限。

经测试，溶液浓度为0.0514 μg/mL 时，信噪比为3.1∶1，此相应浓度作为检测限。

3.2.2 定量限

配制低浓度的头孢氨苄标准溶液，以信噪比约为10∶1 时的相应浓度作为定量限。

经测试，溶液浓度为0.182 μg/mL 时，信噪比为10.3∶1，此相应浓度作为定量限。

3.2.3 线性范围

配置不同浓度的头孢氨苄溶液，在定量限浓度-200%浓度范围内配制6 个浓度的溶液，在测定条件下分别进样，根据测得的峰面积对应的浓度进行线性回归，头孢氨苄线性方程：Y=52287138.9749x+302.2792；相关系数R 值为1.0000；在定量限浓度-200%浓度范围内头孢氨苄浓度与峰面积呈良好的线性关系。

3.2.4 精密度

3.2.4.1 重复性

分别制备供试品溶液6 份注入液相色谱仪，记录色谱图；结果表明：6 份供试品溶液测得的各聚合物含量的RSD 值为5.12%，＜限度20%，说明方法精密度良好。

3.2.4.2 中间精密度

由不同分析人员，在不同仪器条件下进行浓度测定，汇总2 组数据进行分析，计算结果的相对标准偏差，并对测定结果进行评价。结果表明：聚合物含量12 个数据的RSD 为6.79%，均＜20%，说明该方法中间精密度良好。

3.2.5 耐用性

通过改变流速、柱温、检测波长、色谱柱来考察分析方法的耐用性。

供试品溶液在4 ℃条件下分别于0、4、8、12、16、20、24 h 按聚合物方法进行检测，考察溶液的稳定性。结果表明：供试品溶液在4 ℃条件放置24 h，各时间点与0 h 聚合物含量的RD 最大为4.77%，＜10.0%，说明4 ℃条件下供试品溶液可放置24 h。

通过改变流速（0.6±0.1 mL/min）、柱温（25±5 ℃）、波长（220 nm±5 nm）、调整流动相比例及更换不同的色谱柱来考察分析方法的耐用性，每个条件均制备2 份供试品溶液进样测定，同一变化条件下的6 个数据的RSD 值均＜20%，含量变化的绝对值在±0.1%，说明本方法测定头孢氨苄聚合物耐用性良好。

4 结语

本实验是在原检测方法上对流动相中有机相的比例、流动相的pH 值、流速及不同浓度的缓冲盐进行了优化实验，优化后的检测方法能够做到基线分离，能较好地分离头孢氨苄与其聚合物，并对确定好的优化方法进行了检测限、定量限、线性范围、精密度、耐用性的验证，方法重现好，且精密度、准确度均能满足质量控制的要求，对头孢氨苄中聚合物的测定不会产生结果偏差，为检测头孢氨苄聚合物的准确性提供了可靠的依据。