间充质干细胞染色体制片技术的优化

夏福祥

摘要：近年来，在细胞医学方面对于间充质干细胞的有关研究逐渐增多。间充质干细胞作为干细胞的一种，具有较强的分化潜能以及自我调控等特点。在国内外对间充质干细胞应用的诸多研究实践当中，为能够迅速扩大我国间充质干细胞品种的商品化生产面积及尽快满足国内外临床及应用中的特殊需求，对国内外间充质干细胞染色體的制片与技术问题进行开展了一系列各项深入研究探索与方案不断得到优化，本文拟对有关间充质干细胞染色体的相关研究成果进行一个总结，并将讨论今后在其他各项临床研究项目中的关于间充质干细胞染色体的制片方面的技术，以期能够满足间充质干细胞的应用需求。

关键词：间充质干细胞;染色体制片;细胞遗传学;技术优化

引言：

间充质干细胞最早于骨髓中被发现，但目前在胚胎中所提取的间充质干细胞由于其活性及分化特性等方面较骨髓间充质干细胞更优良，因此在国内外受到广泛关注。MSC胚胎也有可能由单独地在同一病人患者体内或同一患者的体外胚胎直接地受宿主机体各种特定生物代谢活动条件等方面的基因诱导的影响情况下分化并发育增殖为寄主机体上各种功能相关的组织细胞，在进行体内胚胎传代分化后的培养与增殖过程及经体内低温冷冻保存和增殖处理后胚胎仍可能依然发育保持并具有表现了其一定或高度发育的各种遗传功能分化特性和生殖潜能，我国医学现阶段目前对于体外MSC的研究及的一些临床及应用领域主要是集中在于临床上与在临床中用于早期诊断或治疗疾病的脊髓骨损伤、脑瘫、系统性红斑狼疮综合征后遗症及小儿脊髓系统性硬化症综合征后等多种神经疾病诊治中，大部分临床研究实验结果都令人满意，因此逐渐将MSC的生产及应用扩大，并对其进行严格的质量控制。

一、间充质干细胞概述

MSC是最早的于哺乳动物骨髓细胞中而被研究发现，但是作为骨髓来源之一的MSC还存在难以制备难以质控、移植骨髓易脱落引起自体免疫反应降低等严重问题，2006年，我国科研人员于哺乳动物胎盘内及动物脐带组织内中均分离培养出了MSC，这种骨髓来源还可永久保持原MSC的生物学特性，并且便于质控，冷冻后细胞损失较小，不易被感染。一般认为骨髓干细胞MSC移植具有很强大的分裂增殖复制能力和胚胎多反向地分化生长潜能，具有细胞免疫功能调节免疫功能，异体细胞移植胚胎排异较轻，在对MSC的质量控制当中大部分在于加强对MSC染色体制片技术等方面。

二、间充质干细胞染色体制片

染色体制片常用于对植物细胞进行制片，一般步骤包括对细胞的处理与固定、解离、染色、压片等等，需要重点和注意到的这一点尤其是我们在进行染色体制片试验的时候也特别地需要着重去关注到细胞分裂相数的相对数量多少与染色体形态。首先对于人体骨髓细胞的染色体制片中，常用秋水仙素进行制片前细胞处理，主要原因在于秋水仙素能够使骨髓细胞保持在分裂中期，在制片后进行观察时能够观察出组织形态良好的细胞组织。所需建议使用的秋水仙素浓度量为10μg/mL，然后放置于在37℃的培养箱环境中培养60min[1]。另外对于干细胞染色体制片还需注意低渗时间及室温关系、固定液比例及固定次数、离心速度及时间、冲洗过程及制片过程等等。在廖继东对胎肝干细胞抗原阳性细胞的研究过程中，对于细胞切片的制片工作中，载玻片是用多聚糖赖氨酸进行处理，在细胞切片制成后于60℃加热，过夜固定[2]。在方利君等对家兔骨髓MSCs的体外培养试验当中，选用了2.5g/L的胰酶室温进行消化约5-10min时间[3]，在唐涛进行的MSC抑制大鼠骨关节炎作用的研究实验研究当中，将骨髓MSC暴露于约37℃、5%的CO2的饱和湿度环境进行体外培养，0.25%的胰蛋白酶进行体外消化试验[4]，在MSC体内向骨骼肌样细胞分化生实验中将胚胎与MSC胚胎同样保存于温度37℃、体积分数大于5%和CO2超饱和高湿度空气中进行培养，用0.25%的胰酶液在室温37℃状态下进行消化约1小时-5min[5]。在国外对MSC细胞的分离培养及其制片加工过程实验当中，随着科学家对纯化MSC技术研究领域的了解不断得到深入，在细胞处理分离方面，常分别使用了密度梯度离心法、贴壁筛选法及对流式细胞仪分选法纯化等纯化方法来直接获得纯度较优纯化的纯化MSC的细胞，以进行染色体制片过程[6]。在欧阳明玥的研究当中，MSC的处理经DPBS洗涤两次后，在室温下450×g离心5 min进行离心，保障干细胞获得良好的分裂相[7]。在对大鼠间充质干细胞的分离与培养研究当中，李延清对离心时间进行了测试，选取其中离心程度最佳的离心速度与实践进行细胞分离操作[8]。较快的离心速度或较长的离心时间都容易造成细胞破裂，影响制片，因此一般离心速度都在1000转/min之内，时间小于10min。孙亚东对人胎儿肺间充质干细胞染色体的制备便采用1000r/min离心5min来获取细胞，然后从细胞膜的破损率来确定制片所需的最佳低渗处理时间。低渗可以使细胞膨胀，从而促进染色体在细胞内均匀地分散开来，制成良好的染色体标本[9]。

间充质不仅能从骨髓中获得，目前也有研究从羊水间获取间充质干细胞，在对其进行培养制片时，用2-3µg/ml 的秋水仙素对细胞进行前处理，培养4-6h，再以1000 r/min的速度离心10 min，37℃低渗5 min，在预固定与固定中均在加入固定液之后，以1000 r/min 离心5 min，再进行烤片、显带与染色[10]。在对人外周血骨髓间充质干细胞的分离培养实验当中，采用了密度梯度离心技术的方法，经5%C02，37℃，饱和湿度条件下进行干细胞培养后，用0.25%胰酶对细胞进行消化[11]。在对大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与纯化等课题研究项目当中，均认为是在37℃，5%的CO2低饱和的湿度状态下进行离心培养，而张本斯则是采用密度梯度离心法，在每分钟1000转/min条件下连续离心培养10min，用胰蛋白酶进行体外消化试验[12]，在肖銮娟的分离纯化实验当中，应用0.25%的胰蛋白酶及0.02%EDTA进行消化功能培养，对MSC进行预处理[13]。

三、间充质干细胞染色体制片技术的优化

从上述对间充质干细胞进行染色体制片的研究当中，对MSC进行染色体制片时，首先需对MSC进行培养，大多数研究都是采用秋水仙碱来进行处理分散干细胞内的染色体，由此来确定低渗溶液的浓度，再用胰酶来进行消化。在大多数实验当中，均是采用0.25%的胰酶来对细胞内的蛋白质进行消化，然后进行离心。低渗溶液则为KCL溶液，在37℃下进行，低渗时间根据实验不同而不同，然后在预固定及固定当中，也需进行离心，再进行烤带、显带与染色。陈茂胜对间充质干细胞染色体制片技术进行了优化，他采用20µg/ml的秋水仙碱培养2h10min，用0.05%胰酶在37℃下进行消化，以1500rpm离心10min，由此来确定低渗溶液的浓度及低渗时间[14]。吴雄志在对骨髓间充质干细胞的研究中则使用胰蛋白酶进行了20min的消化[15]。在进行低渗滤液操作时，国外一般控制在15-30℃之间，控制在20min以内，而国内则大多数控制在37℃之内，并且对低渗的时间与控制室温度还需分别进行分析及计算，以实验室温度为分析基础来分別计算得出最佳的低渗时间，低渗浓度常为0.075mol/L。在预埋固定与固定试验当中，需严格确定固定液量的使用比例范围及固定的次数，实验室工作中最常用的冰醋酸：甲醇=1：2/1：3进行固定，来保证染色体的形状保持原样，在进行预固定及固定时也需进行离心操作，然后再进行烤片等过程。在滴加染液进行染色时，一般采用移液器吸取10μl，再盖上玻片。这种方法能够保证MSC细胞染色均匀，且操作简单[16]。在反复进行的实验工作当中，确定出能够保证获得最佳数据质量的处理液体浓度、离心时间、固定液比例等等，干细胞的细胞密度越大，分析效果越好，因此可从细胞密度来对MSC染色体制片的质量进行把控，提高制片质量，为后期的MSC研究提供便利。

参考文献：

[1]陈超，周婷婷，王双阁，等.骨髓染色体制片方法探讨[J].中国保健营养，2021，31（4）：5.

[2]廖继东，张洹.胎肝干细胞抗原阳性细胞向肾脏细胞分化的研究[J].中华医学杂志，2003，83（19）：1686-1690

[3]方利君，付小兵，孙同柱，李建福，程飚，杨银辉，王玉新，王通.在体诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的初步观察[J].中华创伤杂志，2003，19（4）：212-214.

[4]唐涛，张继虹，孙先润，李治，王波，刘颖，李亚国，肖壮，李连娥.绿色荧光蛋白滑膜间充质干细胞抑制大鼠骨关节炎的实验研究[J].中国医科大学学报，2016，45（10）：913-917.