基于网络药理学及分子对接探讨杜仲叶防治骨质疏松的作用机制

赵继荣 杨涛 陈祁青 马同 赵宁 薛旭 郭培尧 李玮农 张立存

摘要 目的：采用網络药理学-分子对接预测杜仲叶防治骨质疏松症的作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）及SwissTargetPrediction分析平台对杜仲叶活性成分及作用靶点进行筛选，使用GeneCards、在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库、治疗靶点数据库（TTD）对骨质疏松症的对应靶标进行筛选，将中药靶基因与疾病靶基因相交集，将交集靶点导入Cytoscape软件构建成分靶点网络，使用STRING分析平台及Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，筛选核心靶点。对中药-疾病共同靶标进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）功能富集分析，得出中药-疾病共同靶标相关的信号通路，最后运用AutoDock与Pymol软件对预测靶标与其对应的成分进行分子对接。结果：筛选后得到杜仲叶治疗防治骨质疏松症的有效成分7个，杜仲叶-骨质疏松症共同靶标231个，并推断其作用机制可能与动脉粥样硬化信号通路的下游核因子κB信号通路，MAPK信号通路、TNF、PI3K-AKT、IL-17及HIF-1信号通路等有关，且MAPK1、STAT3、VEGFA、IL6、TP53、EGF、AKT1、JUN、MAPK8、EGFR、TNF基因可能起着关键的作用。结论：杜仲叶可能通过减轻氧化应激损伤、抑制破骨细胞形成、促进成骨细胞形成等作用发挥抗骨质疏松作用。

关键词 网络药理学;分子对接;杜仲叶;骨质疏松症;分子机制;信号通路

Mechanism of Eucommia ulmoides Oliv.Leaves in Preventing and Treating Osteoporosis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

ZHAO Jirong1，YANG Tao2，CHEN Qiqing1，MA Tong1，ZHAO Ning1，XUE Xu1，GUO Peiyao1，LI Weinong2，ZHANG Licun2

（ Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，China; 2 Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730030，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Eucommia ulmoides Oliv.Leaves in treating osteoporosis based on network pharmacology and molecular docking.Methods：The active components and targets of E.ulmoides leaves were screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and SwissTargetPrediction，and the corresponding targets of osteoporosis were searched by GeneCards，Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM） and Therapeutic Target Database（TTD）.The targets of Chinese herbal medicine and disease were intersected and input into Cytoscape to construct the component-target regulatory network.The protein-protein interaction（PPI） network was constructed by STRING and Cytoscape to screen the core targets.Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） functional enrichment analysis were carried out on the common targets of Chinese herbal medicine and disease，and the signaling pathways related to the common targets were obtained.Finally，AutoDock and Pymol were used for molecular docking between the predicted targets and its corresponding components.Results：After screening，7 active components of E.ulmoides leaves in the treatment of osteoporosis were obtained，and 23 common targets were identified.The mechanism was inferred to be related to NF-κB，MAPK，TNF，PI3K-Akt，IL-17，and HIF- signaling pathways，and MAPK1，STAT3，VEGFA，IL6，TP53，EGF，AKT1，JUN，MAPK8，EGFR and TNF genes might play a key role.Conclusion：E.ulmoides leaves may exert the anti-osteoporosis effect by alleviating oxidative stress injury，inhibiting osteoclast formation and promoting osteoblast formation.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Eucommia ulmoides leaves; Osteoporosis; Molecular mechanism; Signaling pathway

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.012

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种因骨密度降低和骨组织微结构破坏导致的骨骼强度减低而易发生骨折的慢性骨代谢性疾病[1]。人口老龄化及糖皮质激素的广泛使用使OP已成为“隐形的杀手”[2]。据统计，全球约2亿人患有OP，由其引发的骨折每年高达890万次以上，而在中国，50岁以上的近700万人患有OP，并且每年会造成68.7万例髋部骨折[3]。中医将OP称为“骨萎、骨枯、骨极”，根据中医经典理論“肾主骨生髓”，近年来在探索挖掘中医药防治OP方面成果显著。研究发现补肾中药牛膝[4]、淫羊藿[5]、杜仲[6]等对OP均具有较好的防治效果。而杜仲为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，资源稀缺，是我国特有的第三纪孑遗植物，是国家二级珍贵保护树种[7]，主要药用部位为其干燥树皮，但只有15年以上杜仲树才可剥皮药用，且剥皮后的杜仲树要经过3～4年的生长修复才可再次剥皮，并且常因剥皮后护养不当造成皮剥树死[8-9]。由于杜仲为单科、单属、单种类植物，新药源的开辟只能从其自身非药用部位入手，故杜仲叶能否作为杜仲皮的替代品是目前杜仲新药源的研究热点。杜仲叶（Eucommia Folium）为杜仲科植物杜仲的干燥叶，具有补肝肾、强筋骨之效。用于肝肾不足，头晕目眩，腰膝酸痛，筋骨痿软[10]。研究发现杜仲叶与杜仲皮有效成分及药理作用大致相同。目前从杜仲叶中分离鉴定出有机化合物约70种以上，无机矿物元素15种以上。大致可分为环烯醚萜类、木脂素类、黄酮类、酚类等[11]。其有效成分能够抗肝纤维化，保肝利胆，抑菌抗氧化，并且能够改善骨质疏松的骨微结构，增加骨密度，发挥抗骨质疏松的作用[12]。

本研究采用网络药理学及分子对接技术探索杜仲叶防治OP的作用机制，为进一步研究杜仲叶能否替代杜仲用于防治OP提供科学的理论依据。

资料与方法

1. 资料来源

本研究所使用的研究平台及各大数据库见表1。

1.2 方法

1.2. 筛选杜仲叶主要化学成分

在 中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索杜仲叶化学成分，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18为标准，初步筛选候选化合物，然后进一步查阅文献对化合物进行进一步补充[13]。

1.2.2 收集药物作用靶点

检索TCMSP，筛选出1.2.1中化合物作用靶点，使用UniProt数据库将靶点基因名称规范为官网名称。利用SwissTargetPrediction平台，再次对候选化合物的靶点基因进行预测，然后将筛选出的2个数据库潜在作用靶点合并，删除重复值，得到药物潜在的作用靶点基因。

1.2.3 已知OP疾病靶点基因的获取

在GeneCards、OMIM、TTD数据库中以“osteoporosis”为检索词对已知的OP靶点基因进行检索和筛选，删除重复基因后得到疾病靶点基因。

1.2.4 筛选药物靶点基因和疾病靶点基因的交集

运用Venny平台将1.2.2中所得靶点与1.2.3所得靶点进行交集，所得交集靶点即为杜仲叶治疗OP的可能作用靶点。

1.2.5 构建中药-成分-疾病-靶点网络图

应用Cytoscape 3.7.2软件构建中药、成分、疾病及靶点互作网络。节点（node）表示中药、成分、疾病、靶点。边（edge）表示中药-成分-疾病-靶点之间的相互联系。

1.2.6 Hub网络的提取及Hub中的靶标

利用STRING在线软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络图，将导出string interactions的文件导入Cytoscape 3.7.2软件，对网络进行拓扑分析，计算得Degree、BC、CC的中位数，根据大于2倍Degree中位数和大于其他指标中位数的筛选标准，选出关键节点。

1.2.7 基因功能和富集分析

使用Metascape平台对作用靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）注释分析及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，然后使用GraphPad Prism 7.0将分析结果可视化。

1.2.8 有效成分与核心靶点的分子对接

根据Degree值高低对靶点基因进行排序，在PDB数据库下载相应靶点蛋白结构的3D结构，保存为pdb格式文件，在Pubchem数据库获取有效成分的sdf格式文件，使用Pymol软件将蛋白质分子去水，去磷酸根，使用AutoDockTools进行对接。

2 结果

2. 杜仲叶主要活性成分的筛选

杜仲叶主要活性成分的筛选 在TCMSP数据库中检索得到杜仲叶有效成分78个，根据OB≥30%，DL≥0.18，得有效成分3个，检索相关文献后发现杜仲叶中的苯丙素类化合物绿原酸含量丰富，一般可达1%～5%，为杜仲叶主要成分;而绿原酸能够通过Shp2/Erk信号通路促进大鼠成骨细胞的增值;另外，京尼平苷酸及桃叶珊瑚苷可促进胶原的合成，而Ⅰ型胶原是骨基质中的主要胶原;金丝桃苷可以促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化。因此，经过TCMSP数据库筛选及文献补充，共得到杜仲叶治疗OP的主要活性成分7个。见表2。

2.2 杜仲叶作用靶点预测

经过检索TCMSP数据库，使用Uniprot数据库转化基因名后得到潜在靶点249个，SwissTargetPrediction数据库获得基因靶点500个，将2个数据库基因靶点合并去重后得到杜仲叶治疗OP的潜在靶点基因396个。通过检索GeneCards、OMIM、TTD数据库，删除重复值后得到与OP相关的靶点基因4 138个。使用Venny 2.1.1在线平台将药物作靶点基因与疾病靶点基因进行交集，得到二者的韦恩图及药物疾病的共有靶点基因231个。见图1。

2.3 成分靶点网络的构建

以231个靶基因作为杜仲叶治疗OP的潜在靶点构建杜仲叶治疗OP的成分靶点图。见图2。图中共有238个节点，430条边，节点代表药物成分及作用靶基因，边代表成分与靶基因的相互作用。此图充分体现了杜仲叶多成分、多靶点治疗OP的机制。

2.4 靶基因PPI网络图构建及关键靶基因的筛选

Venny分析得到231个交集靶点导入STRING数据库，去除16个无相互作用的靶点，将导出String Interactions的文件导入Cytoscape 3.7.2软件，对网络进行拓扑分析，计算得Degree、BC、CC的中位数分别为13、0.005 9、0.666 7，根据大于2倍Degree中位数和大于其他指标中位数的筛选标准，选出24个关键节点。见图3。所得关节靶点基因及其Degree、BC、CC值见表3。

2.5 GO注释分析与KEGG富集分析

将杜仲叶治疗OP的231个潜在靶点输入Metascape数据库，对其进行GO注释分析和KEGG信号通路分析，将输出的结果使用GraphPad Prism 7.0进行可视化。杜仲叶治疗OP潜在靶点的GO注释分析见图4，KEGG信号通路可视化见图5。

GO分析结果显示：在分子功能（Molecular Function，MF）（图4A）与激酶结合（Kinase Binding）、蛋白激酶结合（Protein Kinase Binding）、蛋白质结构域特异性结合（Protein Domain Specific Binding）、蛋白激酶活性（Protein Kinase Activity）、内肽酶活性（Endopeptidase Activity）、转录因子结合（Transcription Factor Binding）、核受体活性（Nuclear Receptor Activity）、转录因子活性（Transcription Factor Activity）、磷酸转移酶活性（Phosphotransferase Activity）、激酶活性（Kinase Activity）、蛋白质同源二聚体活性（Protein Homodimerization Activity）等分子功能有关;在生物过程（Biological Process，BP）（图4B）涉及细胞对伤害的反应（Response to Wounding）、细胞对有机氮化合物的反应（Cellular Response to Organonitrogen Compound）、细胞对氮化合物的反应（Cellular Response to Nitrogen Compound）、对脂多糖的反应（Response to Lipopolysaccharide）、细胞因子介导的信号通路（Cytokine-mediated Signaling Pathway）、对细菌来源分子的反应（Response to Molecule of Bacterial Origin）、调节细胞正向迁移（Positive Regulation of Cell Migration）、伤口愈合（Wound Healing）、细胞运动的正向调节（Positive Regulation of Cell Motility）、细胞成分运动的正调节（Positive Regulation of Cellular Component Movement）、对有毒物质的反应（Response to Toxic Substance）等生物过程;而细胞组分（Celluar Component，CC）（图4C）涉及膜筏（Membrane Raft）、膜微区（Membrane Microdomain）、膜区（Membrane Region）、囊腔（Vesicle Lumen）、细胞质囊腔（Cytoplasmic Vesicle Lumen）、细胞外基质（Extracellular Matrix）、胞质核周区（Perinuclear Region of Cytoplasm）、溶泡（Lytic Vacuole）、溶酶体（Lysosome）等组分。

KEGG通路分析显示杜仲叶治疗OP的靶点主要涉及肿瘤（前列腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌）信号途径、PI3K-AKT信号通路、乙肝信号通路、人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型感染、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、动脉粥样硬化信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、内分泌抵抗信号通路、IL-17信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、细胞凋亡、MAPK、HIF-1及FoxO信号通路等多种信号通路。见图5。

2.6 分子对接

对杜仲叶中筛选得到的7个核心成分与Degree值大于35的11個核心靶点进行分子对接，以得到的结合能值作图，其中京尼平苷酸与桃叶珊瑚苷与核心靶点对接失败，其余对接结果见图6。图中横坐标代表靶蛋白，纵轴为杜仲叶活性成分，图中颜色越绿代表结合能越低，颜色越红代表结合能越高，最低结合能≤-5.0 kJ/mol即表明药效分子与靶蛋白对接效果良好，结合能越低，表明分子与靶蛋白结合能力越佳。结果表明山柰酚与活性位点附近的3个Tyr-119及Pro-117、Lys-98这5个氨基酸形成氢键结合到TNF，结合能为-8.48 kJ/mol，与活性位点附近的Ser-153、Arg-191、Trp-192、Gly-230这4个氨基酸形成氢键结合到MAPK1，结合能为-8.08 kJ/mol，与活性位点附近的Tyr-13、Leu-8、Gly-12、Asp-17、Cys-14这5个氨基酸形成氢键结合到EGF，结合能为-7.59 kJ/mol;儿茶素与活性位点附近的2个Tyr-199及Gln-61、Lys-98这4个氨基酸形成氢键结合到TNF，结合能为-7.59;金丝桃苷活性位点附近的2个Glu-116、Ser-99以及2个Tyr-119这4个氨基酸形成氢键结合到TNF，结合能为-7.59，分子与蛋白之间具有强烈的结合活性。分别选择5个关键靶点蛋白具有最低结合能的药效成分绘制对接模式图。见图7。

3 讨论

杜仲属中医补阳药，具有补肝肾、强筋骨之效，在临床使用广泛，疗效显著。但杜仲为单科、单属、单种类植物，新药源的开辟只能从其自身其他部位入手，故杜仲叶能否代替杜仲皮是目前杜仲新药源的研究热点。本研究基于中药-靶点-基因-疾病的研究思路，应用网络药理学及分子对接技术，从微观角度来阐述杜仲叶治疗OP的分子作用机制，为临床能否使用杜仲叶来代替杜仲皮治疗OP提供理论依据。

本研究通过TCMSP检索及查阅文献共筛选得到杜仲叶7个有效成分，即山柰酚、儿茶素、槲皮素、绿原酸[14-15]、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷[16]、金丝桃苷[17]可能具有防治OP的作用;对应活性成分较多的11个靶点MAPK1、STAT3、VEGFA、IL6、TP53、EGF、AKT1、JUN、MAPK8、EGFR、TNF可能为杜仲叶治疗OP的关键作用靶点。黎海霞等[18]通过GWGS（Genome-wide Global Significance）芯片整合分析识别筛选出10个外周血细胞中与OP相关的枢纽基因，其中AKT1基因是度最大的枢纽基因，其影响着破骨细胞和成骨细胞的功能;Zhang等[19]对原发性OP的治疗候选基因做了表达谱的分析，根据PPI网络及其子网络，得出了EGFR、AKT1和转录因子CTNNB1是程度较高的关键节点，其与成骨细胞分化及破骨细胞形成密切相关，可作为OP的治疗靶点。骨代谢生化指标临床应用专家共识（2020）中认为IL-6能够对成骨细胞和破骨细胞的生长和功能进行调节，其与OP的发生密切相关，IL-6升高可作为机体破骨细胞功能活跃的标志[20]，并且有研究表明，OP外周血血清中IL-6的表达水平升高，且与OP患者骨密度降低程度正相关[21]。TNF具有TNF-α与TNF-β 2种亚型，而TNF-α由活化的单核巨噬细胞产生，占TNF总活性的70%～95%，目前常说的TNF多指TNF-α，而TNF-α是重要的破骨细胞调节因子，其与OP的发生密切相关。一项关于TNF-α基因多态性与骨密度和骨质疏松风险的Meta分析结果显示，TNF-α基因G308A多态性可作为筛选、诊断和治疗OP的潜在候选生物标志物，有助于提高临床对OP患者的个体化治疗水平[22]。骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体内或者体外环境中分化为成骨细胞，而TNF-α通过核因子κB信号转导通路损害BMSCs的成骨作用[23]，Yuan等[24]研究发现杜仲叶提取物的主要黄酮类成分槲皮素能够通过拮抗TNF-α而改善大鼠的骨质疏松。VEGFA是VEGF家族的同源基因，已有研究证实原发性成骨细胞中存在功能性VEGF受体，使VEGF在促进成骨细胞增殖和骨重塑中发挥作用[25]。最近的一项研究也表明，在BMSCs中，VEGFA过表达可增强细胞活力和增殖，Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白表达水平明显上调[26]。Min等[27]研究表明VEGFA也在破骨细胞分化中发挥作用。c-Jun是与细胞增殖相关的原癌基因，是调控细胞分化和发育的即刻早期基因，亦称为快速反应基因，c-Jun基因产物直接与成骨细胞增殖和破骨细胞的分化、成熟及功能密切相关[28]。环氧合酶-2（COX-2）亦称为诱导型前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2），Chen等[29]研究发现敲除感觉神经中的前列腺素E 2受体4（EP4）或者成骨细胞中的COX-2基因可显著降低成年小鼠的骨骼体积。而表皮细胞生长因子（EGF）控制促炎信号转导并调节BMSCs的增殖，Müller-Deubert等[30]研究表明表皮生长因子是BMSCs的机械增敏剂，它可能与健康的骨重建和骨折愈合有关。MAP激酶负责转录因子c-Jun在细胞核内的特异性磷酸化，是c-Jun氨基端激酶。因此，MAP激酶也被称为c-Jun氨基端激酶（JNK），JNK是与破骨细胞发生相关的最关键的通路之一[31]。Lee等[32]用甲基乙二醛处理RAW264.7巨噬细胞，发现JNK是最有可能参与激活破骨细胞的因子。

GO富集分析结果显示杜仲叶有效成分的活性靶点是通过影响含氮化合物的合成，细胞及成分迁移运动，蛋白酶及蛋白激酶的活性等方面来防治OP的发生的。KEGG富集分析结果显示动脉粥样硬化信号通路、PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、IL-17信号通路可能是杜仲叶防治OP的主要通路。动脉粥样硬化信号通路及TNF信号通路下游通路包括核因子κB号通路、MAPK信号通路、凋亡信号通路等。Yin等[33]研究发现甘氨酸可以抑制破骨细胞形成和骨吸收功能，并能部分抑制去卵巢小鼠的骨质疏松，而这些作用主要是通过抑制RANKL诱导的核因子κB、ERKB和JNK 3条通路的激活来实现的。MAPK信号通路对于破骨细胞的形成和活化具有重要作用，沈云玲等[34]研究发现阿侖膦酸钠可能通过调控核因子κB和MAPK信号通路产生抗OP的作用。季康等[35]研究发现唑来膦酸注射液联合降钙素治疗老年性骨质疏松疗效显著，可降低血清IL-6、TNF-α水平。PI3K-AKT信号通路是细胞凋亡的重要通路，毛滔等[36]研究发现lncRNA NEAT1可能通过抑制PI3K/AKT/Bcl-2信号通路促进OP。李运江[37]研究认为IL-17对成骨细胞生长起消极作用，不通过自噬介导，IL-17负向调控成骨细胞的分化，可能部分通过自噬作用介导。钟航等[38]研究发现HIF-1信号通路参与了小鼠绝经后OP的病理学改变，抑制HIF-1信号通路可改善PMOP的严重程度，而PMOP破骨细胞内HIF-1信号通路的上调可能与AKT、ERK、核因子κB这3条信号通路有关。这些富集度高的信号通路主要通过减轻氧化应激损伤、抑制破骨细胞形成、促进成骨细胞形成等作用发挥防治骨质疏松作用。

综上所述，杜仲叶对治疗OP具有多成分、多靶点、多通路的治疗特点;同时也启示我们在治疗OP方面，杜仲叶可能能够作为杜仲皮的替代品;但是上述研究也存在一定的局限性，需要基础研究及临床试验的进一步确证。

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（2021-02-24收稿 本文编辑：魏庆双）