汶川县水磨镇绿茶中花青素提取工艺优化

廖 辉，刘 林，戴先芝，赵文慧

（阿坝师范学院，四川汶川 623000）

汶川县产茶历史悠久，距今已有一千多年的历史。水磨镇是汶川县南部的一个重要茶叶产地，2014年5 月成立水磨镇二村沟茶叶种植专业合作社，其茶园种植面积达200 多hm2。水磨镇位于北纬30°～31°、东经102°～103°，海拔1 000 m，属亚热带山区，河流广阔，降雨量丰富，气候宜人，空气湿度相对较大，利于茶叶生长[1-2]。

近年来，茶叶花青素成为研究热点[3-5]。茶叶花青素具有很强的生物活性，可广泛用于食品、饮料、医药、化工和纺织等行业。前人研究表明，茶树芽叶颜色与花青素含量呈明显的正相关。花青素含量与茶树生长环境关系密切，光照强有利于花青素的累积，强紫外光条件下，茶树体内新陈代谢也会促进花青素的形成[4]。花青素是重要的生物活性补充剂，红茶加工会导致茶叶花青素含量显著减少，绿茶加工对茶叶花青素含量的影响不大[6]。

花青素提取大多采用有机溶剂提取方法，辅以超声、微波、加压或者酶解等可以提高花青素的提取率。徐烨等[7]采用微波与超声处理花青素-多酚液态和固态模拟体系，阐释微波与超声处理对花青素-多酚相互作用呈色的影响机制。魏心源等[8]综述了乙醇浸提法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法提取黑豆中花青素的研究进展。张东方等[9]以茄子果实作试验材料，利用光谱仪扫描果皮获取其光谱反射率，使用pH 示差法测量花青素含量。黄武等[10]在超声辅助提取的基础上，结合水浴浸提探究花生红衣中原花青素的提取方法，用正交试验对工艺进行优化。吕品等[11]利用香草醛法测定莽吉柿果壳原花青素的含量，借助响应面法分析显色条件，发现采用硫酸作为酸化介质，体系的稳定性较强；对测定影响最大的因素是硫酸浓度，其次是香草醛浓度，影响最小的是反应温度。

目前相关研究中大多是以酸性极性溶剂作为提取剂。国外学者Deineka 等[12]把从东方紫荆叶中提取的物质，动态固相纯化后，在Agilent1200 上分离出花青素，考查酸/磷酸-水体系、乙腈和酸浓度对花青素色谱行为的影响。Huang 等[13]利用超高效液相色谱-串联质谱法提取红豆杉果实花青素，结果在“大红1号”果皮中鉴定出17 种花青素，发现果实颜色变异与某几种花青素含量相关。Li 等[14]用50% AcOHMeOH 提取剂从“香港红山茶”的山茶科植物中提取鉴定了12 种花青素。王秋霜等[15]以80%乙醇、0.6%盐酸为提取剂，利用超声辅助从红紫芽茶叶中提取分离到的花青素含量达3.782 5 mg·g-1；刘长姣等[16]以0.8%盐酸-50%乙醇水溶液作提取剂，通过水浴振荡从黑米提取到的花青素含量为1.249 mg·g-1；李绍波等[17]用0.5%硫酸乙醇作提取剂，从紫甘薯中提取出3.671 6 mg·g-1的花青素。花青素含量测定常用pH 示差法、紫外分光光度法、高效液相色谱法。目前，水磨绿茶茶叶的花青素相关研究还未见报道。本试验采用传统的有机溶剂提取并以超声水浴作为辅助，设计了4 个单因素试验，并结合正交试验探讨水磨绿茶中花青素的最佳提取条件，通过紫外分光光度计测定出花青素含量。

通过溶剂极性减少其他杂质的浸出，并以1%盐酸维持提取剂的酸性以保证花青素的稳定性，同时使茶叶中的原花青素、花白素二者部分转化成花青素，通过溶剂萃取法再次分离出提取液中的花青素，采用乙酸乙酯萃取出提取液中的咖啡碱、儿茶素等[18-19]，最终测得茶叶中的总花青素含量。已有的试验结果表明，使用甲醇提取能在提取过程中很大程度上减小除花青素以外的极性杂质浸出对花青素纯度的影响[5]，但甲醇的毒性大且挥发性强，秉着绿色生态理念，选择乙醇作提取剂更好。此外，利用单纯的有机溶剂进行提取的效果并不好，因为其渗透性较差，加入一定比例的蒸馏水作传质[5]反而起了很好的效果，因而在本试验中选择酸性乙醇水溶液作提取溶剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样品：选取水磨镇大二沟村4 月的绿茶茶叶（一芽二叶，烘干），粉碎，备用。

药品：花青素（标准品）、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（CAS：7084-24-4，BZP0428）、盐酸（AR）、无水乙醇（AR），均购自四川西陇科学有限公司；乙酸乙酯（AR），购自成都市科隆化学品有限公司。

仪器设备：UV-1800PC 紫外可见分光光度计；JJ324BC 型电子天平；PS-100A 超声清洗仪；880Y高速多功能粉碎机；蜀牛GG-17 抽滤瓶；SHB-Ⅲ循坏水式多用真空泵；TDZ6B-WS 台式低速自动平衡离心机。

1.2 试验方法

1.2.1 确定最大吸收波长

准确称量0.005 0 g 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（标准品），用无水乙醇、1%盐酸、蒸馏水体积比为2∶1∶1的溶剂进行溶解，并将其转移至50 mL 容量瓶中，定容，配制成0.10 mg·mL-1标准溶液。在准确移取1.5 mL标准溶液于25 mL 容量瓶中，定容。在240～700 nm波长范围内进行紫外-可见分光光度计光谱扫描，确定最大吸收波长。

1.2.2 绘制标准曲线

分别准确移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的标准溶液于25 mL 容量瓶中，加入无水乙醇、1%盐酸、蒸馏水体积比为2∶1∶1 的溶剂定容，即得到6 个浓度的系列标准溶液。在步骤1.2.1 所确定的最大吸收波长处测定，绘制出标准曲线，并得到线性回归方程。

1.2.3 单因素试验

乙醇浓度的选择：准确称量7 份1.2 g 绿茶样品于250 mL 锥形瓶中，分别加入浓度为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的30 mL 乙醇溶液，15 mL 1%盐酸，15 mL 蒸馏水，超声水浴温度60 ℃，提取时间25 min。抽滤、放置冷却，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的转速离心10 min，测定并记录各澄清液的吸光度值。

料液比的选择：准确称量6 份1.2 g 绿茶样品于250 mL 锥形瓶中，各加入料液比为1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50 的60%乙醇溶液、1%盐酸与蒸馏水，三者的用量按照60%乙醇、1%盐酸、蒸馏水体积比2∶1∶1 确定，超声水浴温度60 ℃，提取25 min。抽滤、放置冷却，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的转速离心10 min，测定并记录各澄清液的吸光度值。

提取温度的选择：准确称量6 份1.2 g 绿茶样品于250 mL 锥形瓶中，各加入料液比为1∶40 的60%乙醇溶液、1%盐酸和蒸馏水，三者的用量按照60%乙醇、1%盐酸、蒸馏水体积比2∶1∶1确定，超声水浴温度分别设定为30、40、50、60、70、80 ℃，提取25 min。抽滤、放置冷却，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的转速离心10 min，测定并记录各澄清液的吸光度值。

提取时间的选择：准确称量6 份1.2 g 绿茶样品于250 mL 锥形瓶中，各加入料液比为1∶40 的60%乙醇溶液、1%盐酸和蒸馏水，三者的用量按照60%乙醇、1%盐酸、蒸馏水体积比2∶1∶1 确定，超声水浴温度60 ℃，提取时间分别设定为10、20、30、40、50、60 min。抽滤、放置冷却，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的转速离心10 min，测定并记录各澄清液的吸光度值。

1.2.4 正交试验

以乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间等4因素，设计正交试验，优化绿茶花青素提取条件。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

同1.2.1 的操作方法，在240～700 nm 波长扫描，确定其最大特征吸收波长为531 nm，并绘制矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的标准曲线。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷浓度范围为0.000～0.024 mg·mL-1，得到其线性回归方程：C＝0.019 8×A+0，相关系数R＝0.999 9，如图1所示。

图1 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准曲线

式（1）中，C为回归方程下的花青素浓度，g·L-1；V为提取剂体积，L；m为绿茶样品质量，kg。

2.2 单因素试验结果

单因素试验结果表明，选择70%乙醇浓度（见图2），料液比1∶45 （见图3），超声水浴温度为70 ℃（见图4），超声提取时间60 min （见图5），花青素提取率高。

图2 乙醇浓度对绿茶中花青素含量的影响

图3 料液比对绿茶中花青素含量的影响

图4 温度对绿茶中花青素含量的影响

图5 提取时间对绿茶中花青素含量的影响

2.3 正交试验结果

根据单因素试验结果，选取4 因素3 水平，设计正交试验（见表1）。

表1 正交试验因素水平表

由表2 可知，影响绿茶中花青素提取含量的因素排序为：料液比＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间。提取条件：乙醇浓度70%，料液比1∶45，温度70 ℃，时间60 min。平行测定三个样，相对平均偏差为1.1%，测定出绿茶中花青素含量为0.460 3 mg·g-1。

表2 正交试验结果

3 讨论

采用超声水浴辅助-有机溶剂浸取的方式提取绿茶中的花青素，紫外分光光度计测定其含量。筛选出较优的提取条件为乙醇浓度70%，料液比1∶45，温度70 ℃，时间60 min，提取到水磨绿茶中花青素含量为0.460 3 mg·g-1。与红紫芽叶茶相比，水磨当地种植的绿茶中花青素含量偏低。要发展水磨绿茶产业，可从改良水磨当地绿茶的品种着手，有研究证明芽叶颜色深浅与花青素含量有着密切关系，开发种植茶树新品种，使其具有高含量的花青素，有利于水磨茶叶品质改良。

茶产业带来的效益推动了当地经济的发展，除了通过打造茶旅融合、对外销售的方式来促进茶产业发展外，还可以开发茶叶深加工产品，发掘茶叶更大的价值，助推当地经济发展。