超声波辅助提取蔓越莓中原花青素及其抗氧化性研究

钱玉玲，王维维，荣国强，成 蔚，单玲玲

（宿州学院，安徽宿州 234000）

蔓越莓，又称蔓越橘，是杜鹃花科越橘属的常绿小灌木，主要生长在北半球的凉爽地带酸性泥炭土壤中，在中国大兴安岭地区也比较常见［1］.蔓越莓提取物含有丰富的膳食纤维、维生素、矿物质、无机盐等，其中富含的原花青素，由于其特殊的抗氧化能力，可避免细胞被破坏并维持细胞的健康与活力［2］.原花青素是一种存在于自然中的天然多酚，其主要结构是儿茶素、表儿茶素或者二者之间的聚合体［3］，具有抗氧化、延缓人体衰老的作用，还可以治疗消化系统疾病和尿道感染［4］，对糖尿病的治疗也有辅助作用［5］.

从蔓越莓中提取原花青素的方法较多，如有机溶剂萃取法、微波辅助提取法、超声波提取法、酶提取法［6］等.其中超声波辅助提取法与其他方法相比更快捷，提取效率更高，操作简单，安全并对环境友好［7−8］.本研究采用微波辅助提取法萃取蔓越莓中的原花青素，采用正交试验优选工艺条件来提高其提取率，并对其抗氧化性进行分析［9］，以期为我国蔓越莓资源的开发利用奠定一定的理论基础.

1 试验材料与仪器

试验材料蔓越莓为市售，原花青素标准品、丙酮、乙酸乙酯、无水乙醇、石油醚均为国药集团分析纯.

试验仪器有HI84−SYW140 型电热鼓风干燥箱，白山市玖久仪器仪表有限公司家；UV−2810 型紫外可见分光光度计，HITACHI 公司；DJ−10A 倾倒式粉碎机，上海隆拓仪器设备有限公司；KQ−2200B型超声波仪，昆山市超声仪器有限公司；SHZ−D 循环水真空泵，巩义市予华仪器有限公司；RE−501型旋转蒸发器，巩义市科瑞仪器有限公司.

2 试验方法

2.1 蔓越莓的预处理

将蔓越莓洗净，烘干，粉碎，过40目筛，石油醚脱脂，干燥备用.

2.2 提取工艺流程

蔓越莓粉末→加入提取剂→超声波提取→抽滤→浓缩→冷冻干燥.

2.3 蔓越莓原花青素的鉴定

将原花青素标准品在紫外可见分光光度计的200～600 nm 波段扫描，检测提取物与标准品波峰是否一致，以鉴定提取物是否属于原花青素.

2.4 蔓越莓原花青素含量测定

2.4.1 标准曲线的绘制

准确称取20.00 mg 原花青素标准品，用甲醇定容至10 mL，配制成质量浓度为2 mg/mL 的原花青素标准品溶液.分别吸取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 mL上述原花青素标准品溶液于7支具塞试管中，各加入甲醇定容至2 mL后，加入8.0 mL反应混合液（按体积比为正丁醇∶浓盐酸∶10%硫酸铁铵=83∶6∶1），盖紧塞子，振荡摇匀，于沸水浴中反应40 min，取出快速冷却至室温，以试剂空白为对照，在520 nm波长处测定吸光度.每组均测定3次后取平均值，记录数据，以吸光度值为横坐标，原花青素的浓度为纵坐标，绘制出标准曲线，得回归方程.

2.4.2 蔓越莓原花青素得率的计算

准确吸取1.0 mL 定容后的蔓越莓原花青素浸提液，测定其在520 nm 波长处的吸光度值，根据标准曲线方程计算出样品浓度，蔓越莓原花青素得率的计算公式为：

式中：C为蔓越莓原花青素的浓度（µg/mL）；V 为稀释后的原花青素溶液总体积（mL）；M 为样品的质量（µg）.

2.5 单因素试验和正交试验

分别考察超声波辅助提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度4 种因素对蔓越莓原花青素提取率的影响.其中超声波辅助提取时间分别为20、30、40、50 min；提取温度分别为40、50、60、70℃；料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50；乙醇浓度分别为25%、50%、75%、100%.

根据单因素试验结果，对每个因素选择合适的水平，应用正交表见表1，开展L9（34）正交试验，根据收率得出蔓越莓原花青素的最佳提取工艺.

表1 正交试验因素水平

2.6 蔓越莓原花青素抗氧化能力测试

取1.0 mL 最优提取工艺下提取出的蔓越莓原花青素抽滤液，稀释10倍，分别加入1%，2%，3%，4%浓度的氧化剂双氧水和过硫酸钾各1.0 mL，混合均匀，使其暴露于空气中，室温下放置30 min，测定含量.

取1.0 mL 最优提取工艺下提取出的蔓越莓原花青素抽滤液，稀释10 倍，分别加入0.5%，1.0%，1.5%，2.0%浓度的还原剂硫酸亚铁和硼氢化钠各1.0 ml，混合均匀，使其暴露于空气中，室温下放置30 min，测定含量.

3 实验结果与分析

3.1 提取时间对蔓越橘中原花青素提取效果的影响

从图1可以看出，当超声波提取的时间变长时，从蔓越莓中所得原花青素的得率先增大后减小，当提取时间为40 min时，原花青素得率为最大值，即已经达到最大提取效率，若继续延长提取时间，原花青素得率反而会降低.这可能是因为原花青素的结构不稳定，提取时间过长会使一部分的原花青素的结构遭到破坏而分解［10］，故40 min为最优提取时间.

图1 提取时间对蔓越莓中原花青素提取率的影响

3.2 提取温度对蔓越莓中原花青素提取效果的影响

从图2 可得，当超声波提取温度升高的时候，原花青素的得率先升高后降低.当提取温度为60℃时，原花青素得率为最大值，如果继续增高超声波提取温度，会造成花青素结构被破坏，原花青素得率反而会降低.这是可能因原花青素是易氧化物质，结构不是特别稳定，温度过高时，原花青素的结构会被破坏，温度越高，原花青素被破坏的越多，故60℃为最优提取温度.

图2 提取温度对蔓越莓中原花青素提取率的影响

3.3 料液比对蔓越莓中原花青素提取效果的影响

从图3 可以看出，当料液比增加时，所得原花青素的得率先升高然后降低，当料液比为1∶30（g/mL）时，原花青素得率达到最大值，即提取效果最好，若继续提高料液比，提取出的原花青素溶液浓度会变低，造成原花青素得率降低，并且会浪费提取溶剂，故1∶30（g/mL）为最佳料液比.

图3 料液比对蔓越莓中原花青素提取率的影响

3.4 乙醇浓度对蔓越莓中原花青素提取效果的影响

从图4 可以看出，当乙醇浓度增加时，所得原花青素的得率先升高后降低.当乙醇浓度为50%时，原花青素得率为最大值，如果继续增加乙醇的浓度，高浓度的乙醇可能会破坏原花青素分子.一定浓度的水进入植物的细胞之中会将有效成分提取出来，但非结合水的量太多，能溶于其中的杂质也会越多，这些杂质会对原花青素的提取造成干扰［11］，故50%浓度的乙醇为最适浓度.

图4 乙醇浓度对蔓越莓中原花青素提取率的影响

3.5 超声波提取蔓越莓原花青素条件优化

以4个单因素试验结果为前提条件，开展L9（34）正交试验，结果见表2.

表2 正交试验结果

从表2 中的结果可知，4 个因素对试验结果影响顺序为：料液比>提取温度>乙醇浓度>提取时间；蔓越莓中原花青素的最优提取工艺为A2B3C1D2，即提取时间40 min，提取温度70℃，料液比1∶20，乙醇浓度50%.

3.6 蔓越莓原花青素抗氧化、还原能力测试

3.6.1 双氧水（H2O2）对蔓越莓原花青素的影响

从图5 可以看出，在低浓度时双氧水的氧化性对于蔓越莓原花青素结构的破坏作用并不明显，当向原花青素溶液中加入2.0%浓度的双氧水时，原花青素含量仍为9.10%，说明蔓越莓原花青素对双氧水的氧化性有一定的抵抗力.

图5 H2O2对蔓越莓原花青素抗氧化性的影响

3.6.2 过硫酸钾（K2S2O8）对蔓越莓原花青素的影响

从图6可以看出，过硫酸钾的氧化性对于蔓越莓原花青素的破坏作用并不明显，当向原花青素溶液中添加2.0%浓度的过硫酸钾时，原花青素含量仍为8.87%，说明蔓越莓原花青素对过硫酸钾的氧化性有一定的抵抗力.

图6 K2S2O8对蔓越莓原花青素抗氧化性的影响

3.6.3 硫酸亚铁（FeSO4）对蔓越莓原花青素的影响

由图7可得知，当加入过硫酸钾的浓度低于0.5%时，对蔓越莓原花青素结构的破坏作用并不明显，但是超过0.5%时就会明显的造成蔓越莓原花青素结构的破坏，当向原花青素提取液中加入2.0%浓度的硫酸亚铁时，原花青素含量仅为0.02%，说明蔓越莓原花青素对还原剂硫酸亚铁抵抗力较弱.

图7 FeSO4对蔓越莓原花青素抗氧化性的影响

3.6.4 硼氢化钠（NaBH4）对蔓越莓原花青素的影响

从图8可以看出，还原剂硼氢化钠对蔓越莓原花青素有较大的破坏作用，硼氢化钠的浓度为0.5%时，原花青素含量仅为2.23%，说明蔓越莓原花青素对还原剂硼氢化钠完全没有抵抗力.

图8 NaBH4对蔓越莓原花青素抗氧化性的影响

4 结论

本研究以蔓越莓为原料，利用安全并对环境友好的超声波辅助提取法提取蔓越莓中原花青素，考察了提取时间、提取温度、料液比，乙醇浓度4 个因素对于原花青素提取率的影响，并通过正交试验对其提取进行优化，得出最佳提取条件为：提取时间40 min，提取温度70℃，料液比1∶20，乙醇浓度50%，该条件下，原花青素的提取率为11.65%.通过蔓越莓中原花青素抗氧化还原实验研究表明：蔓越莓中原花青素对氧化剂的氧化性有一定的抵抗力，具有较好的抗氧化性；对于还原剂的还原性抵抗能力极弱，0.5%浓度的还原剂即可明显破坏蔓越莓中原花青素的结构.