rs66593747基因型对矮小症患儿Cor IGF-1水平及rhGH疗效的影响

王嫣嫣 王晓萌 卢军见

矮小症在中小学生群体中发病率达3%，治愈率却低于1%[1-2]。研究[3-4]发现，矮小症发生与生长激素分泌不足与缺乏、骨骼发育异常等因素有关。研究[5-6]发现，内质网应激可以经由调节软骨细胞、成骨细胞以及破骨细胞等生长发育介导骨相关疾病发生与进展，而7号染色体上人类同源物(BBF2 human homolog on chromosome 7，BBF2H7)基因与机体内质网应激关系密切。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)为调节生长发育重要激素之一，与矮小症发生以及病情进展关系密切[7]。皮质醇(cortisol，Cor)可经由抑制胰岛素样生长因子结合蛋白-2降解抑制机体IGF-1，影响机体生长发育[8]。重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)为矮小症常用治疗药物，促进矮小症儿童身体生长发育[9]。本研究旨在探究BBF2H7基因rs66593747位点基因型对矮小症患儿血清Cor、IGF-1水平及rhGH疗效影响，为矮小症患儿遗传发病原因研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年12月至2020年7月顶山市第一人民医院和郑州市儿童医院收治的93例矮小症患儿以及同期在平顶山市第一人民医院和郑州市儿童医院进行体检的35例健康儿童分别作为研究组与对照组。研究组男性56例，女性37例；年龄4～12岁，平均(8.15±1.76)岁。对照组男性24例，女性11例；年龄3～13岁，平均(8.92±1.64)岁。两组对象一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具可比性。

研究组纳入标准：①符合第7版《诸福棠实用儿科学》矮小症诊断标准[10]；②血脂以及血常规检查结果正常；③甲状腺功能以及智力正常；④在入组前患儿未接受治疗或者近期未服用外源性维生素D、肾上腺皮质激素等治疗；⑤研究对象家属同意参与研究，符合《赫尔辛基宣言》中伦理学要求。对照组纳入标准：发育及心理状况正常，研究对象家属同意参与研究，符合《赫尔辛基宣言》中伦理学要求。两组对象排除标准：①肝肾功能损伤者，存在中枢神经系统疾病或者营养不良、肥胖、糖尿病等情况者；②继发因素所致的生长激素分泌障碍；③存在遗传代谢疾病、甲状腺功能异常、骨骼发育异常者。

1.2 方法

1.2.1 rs66593747位点基因型检测 研究组在进行治疗前、对照组在体检当日采集肘静脉血3 mL，以10 000 r/min转速进行1 min离心，收集上清液，应用RNA提取试剂盒进行总RNA抽提，随后应用逆转录试剂盒逆转录获得cDNA。基因型应用聚合酶链反应进行检测，选择β-actin作为模板，将引物、SYBR Green染料、dNTP加入反应体系中使其体积达20 μL，反应条件设置：93℃、93℃、55℃条件下分别处理2 min、1 min、2 min， 40个循环。基因检测引物与试剂盒购自上海赛默飞世尔科技有限公司，rs66593747位点：上游5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，下游5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’；内参基因GAPDH：上游5’-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3’，下游5’-AAATGAGCCCCAGCCTTC TC-3’。

1.2.2 血清Cor与IGF-1水平测定 研究组在治疗前、对照组在体检当日采集肘静脉血3 mL以4 000 r/min速度离心处理10 min后取上清液，血清Cor与IGF-1水平分别应用免疫化学发光法与酶联免疫吸附法进行测定，测定按照试剂盒说明书进行操作。试剂盒购自厦门市波生生物技术有限公司与罗氏生物科技有限公司。

1.2.3 rhGH治疗 研究组对象进行营养支持治疗，保持充足睡眠，同时补充一定量的维生素B12以及钙，口服司坦唑醇(广西南宁百会药业集团有限公司，国药准字H45020728，规格：2 mg×12片×2板)，睡前0.5～1.0 h在臀部外上限或者腹部脐周位置皮下注射rhGH(长春金赛药业股份有限公司，国药准字S10980101，规格：每瓶4.5 IU/1.7 mg/1.0 mL)，注射剂量为30 μg/(kg·d)，频率为1次/天，6个月为1个周期，共2个周期。疗效评价[11]：依据患儿身高增长情况评估患儿治疗疗效，有效为经过治疗后身高增长超过3 cm，无效为患儿经过治疗后身高增长不足3 cm。

2 结果

2.1 两组对象rs66593747位点哈德温伯格平衡检验比较 研究组与对照组对象rs66593747位点AA、AT、TT基因型观察值与期望值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，符合哈德温伯格平衡。见表1。

表1 两组对象rs66593747位点哈德温伯格平衡检验比较

2.2 两组对象rs66593747位点基因型、血清Cor与IGF-1水平比较 研究组对象rs66593747位点AT基因型频率、血清IGF-1水平低于对照组(P<0.05)，rs66593747位点TT基因型频率、血清Cor水平高于对照组(P<0.05)，两组对象rs66593747位点AA基因型频率以及A、T等位基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组对象rs66593747位点基因型、血清Cor与IGF-1水平比较

2.3 rs66593747位点基因型、血清Cor、IGF-1水平与矮小症发生多元logistic回归分析 以矮小症发生为因变量(Y=矮小症；是=1，否=0)，以研究组与对照组rs66593747位点基因型(X1=rs66593747位点基因型；1=AA，2=AT，3=TT)，及血清Cor(X2=Cor水平)、IGF-1(X3=IGF-1水平)水平比较存在统计学差异的指标为自变量进行多元logistic回归分析，以输入方式筛选变量，纳入3个自变量均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 rs66593747位点基因型、血清Cor、IGF-1水平与矮小症发生多元logistic回归分析

2.4 不同rs66593747位点基因型患儿血清Cor、IGF-1水平比较 AT型患儿血清Cor水平低于TT型与AA型，IGF-1水平高于TT型与AA型(P<0.05)；TT型与AA型基因患儿血清Cor、IGF-1水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同rs66593747位点基因型患儿血清Cor、IGF-1水平比较

2.5 不同rhGH治疗疗效患儿rs66593747位点基因型、血清Cor及IGF-1水平比较 93例患儿采用rhGH治疗后有效72例(有效组)，无效21例(无效组)。有效组患儿AT基因型频率与IGF-1水平高于无效组，Cor水平低于无效组(P<0.05)，有效组与无效组患儿TT、AA基因型频率及T、A等位基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 不同rhGH治疗疗效患儿rs66593747位点基因型、血清Cor及IGF-1水平比较

2.6 患儿rs66593747位点基因型与血清Cor、IGF-1水平、rhGH治疗疗效相关性分析 Spearman相关性分析显示，rs66593747位点基因型与血清Cor负相关、与IGF-1正相关、与rhGH治疗疗效无相关性(r=-0.354，P<0.001；r=0.312，P<0.001；r=0.062，P=0.554)。见图1～3。

图1 rs66593747位点基因型与血清Cor水平相关性箱式图

图2 rs66593747位点基因型与血清IGF-1水平相关性箱式图

图3 rs66593747位点基因型与rhGH治疗疗效相关性箱式图

3 讨论

生长激素(growth hormone，GH)/IGF-1轴及其他相关信号通路介导机体生长发育，相关基因遗传缺陷，造成矮小症发生，其中内质网应激可以通过介导骨代谢平衡影响机体生长发育[12-13]。BBF2H7基因为内质网应激传感器，可由对应通路促进软骨基质蛋白释放以及软骨细胞增殖，介导机体生长发育，而rs66593747位点处于BBF2H7基因上，可能在机体生长发育中发挥重要作用[14]。本研究结果显示，研究组与对照组rs66593747位点AT以及TT基因型频率存在差异，可能与矮小症发生有关。但多因素回归分析显示AT、TT基因型并不是矮小症发生影响因素，rs66593747位点可能并不直接影响矮小症发生，或经其他途径介导矮小症发生。

Cor水平过高表明机体蛋白质以及脂肪分解速度加快，导致机体蛋白质储备不足，使机体生长发育受到影响[15-16]。IGF-1反映了GH自主分泌情况，可以促进机体蛋白质形成以及骨骼发育，IGF-1水平低反映了机体对于蛋白质形成、骨骼发育调节作用不足，影响机体生长发育[17-18]。本研究结果显示，相对于TT型与AA型患儿，AT型基因患儿血清Cor水平较低，IGF-1水平较高，表明rs66593747位点基因型可能经由调节下游细胞因子水平而影响矮小症发生。国内研究[19]发现，rs66593747位点GT基因型IGF-1水平显著高于GG型与TT型，但是该研究认为rs66593747位点作为内质网应激途径中重要成员，介导分泌蛋白以及膜蛋白分泌，调节钙磷平衡，介导机体生长发育。相关性分析显示，rs66593747位点基因型与患者血清水平Cor水平、IGF-1水平存在相关性，笔者推测，rs66593747位点基因型通过上调机体IGF-1水平，抑制Cor表达，间接影响机体生长发育。

rhGH为人工合成生长激素，可发挥与天然生长激素相同生物学作用[20]。本研究结果显示，有效组患儿AT基因型频率与IGF-1水平明显高于无效组，Cor水平明显低于无效组，显示rs66593747位点AT基因型疗效相对较好。分析认为，rs66593747位点AT基因型可以上调机体IGF-1水平，抑制Cor表达。谢坤霞等[14]研究也显示，rs66593747位点基因型与rhGH治疗疗效有关，但rhGH治疗疗效与GT基因型相关性最高，这可能与不同地区、不同种族有关。虽然本研究中有效组与无效组患者rs66593747位点AT基因型频率比较差异存在统计学意义，但相关性分析结果显示两者不相关，这可能与rs66593747位点基因型对于矮小症发生影响一致、rs66593747位点基因型并不直接影响患者治疗效果等有关。

综上所述，rs66593747位点基因型与矮小症患者血清Cor、IGF-1水平关系密切，但是不会影响rhGH治疗疗效，可以为患者病情评估以及疗效预测提供参考。