阿托伐他汀通过Nrf2/HO-1改善慢性心力衰竭大鼠心功能的作用及机制研究

任慧敏 韩树池 苑 萌 马力丰 李文卉

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各种心脏疾病的终末阶段，对患者的日常生活及远期预后均产生不利影响[1-2]。近年关于CHF发病机制的研究认为，氧化应激反应的过度激活与心肌损伤及重构、心脏结构和功能改变有关。核因子 E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)/血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)通路是体内重要的抗氧化通路，腹主动脉缩窄法建立的CHF大鼠模型中及异丙肾上腺素诱导心肌细胞肥大模型中均检测到Nrf2及HO-1表达降低，激活Nrf2显著改善CHF大鼠的心功能，提示激活Nrf2是防治CHF的重要靶点[3-5]。阿托伐他汀是临床上广泛使用的调脂药物，王志利等[6]的动物实验证实阿托伐他汀对急性心肌梗死大鼠的心功能具有改善作用，对缺血心肌组织中Nrf2/HO-1通路具有激活作用，基于此提出假说：阿托伐他汀可能在心脏中参与Nrf2/HO-1通路的调控，进而可作为防治CHF的药物。为了验证这一假说，本研究通过腹主动脉缩窄法建立CHF大鼠模型，分析阿托伐他汀通过激活Nrf2/HO-1通路改善CHF大鼠心功能的效果及机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康SPF级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，8～10周龄[购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，生产许可SCXK(沪)2017-0012]。

1.2 药品与试剂 阿托伐他汀钙(辉瑞制药公司，美国)，Nrf2抑制剂ML385(MCE公司，美国)、用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配置储存液(浓度为25 mg/mL)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-hydroxy deoxyguanine，8-OHdG)、总抗氧化力(total antioxidant capacity，T-AOC)检测试剂盒(南京建成研究所，中国江苏)，组织裂解液(碧云天公司，中国上海)，Nrf2、HO-1、β-actin单克隆一抗(Abcam公司，美国)。

1.3 仪器 小动物超声仪(S-Sharp公司，美国)，凝胶电泳仪(Bio-rad公司，美国)，凝胶成像仪(天能公司，中国上海)。

1.4 方法

1.4.1 分组、造模及给药 实验动物随机分为假手术(SHAM)组、CHF组、阿托伐他汀组、DMSO+SHAM组、DMSO+CHF组、DMSO+阿托伐他汀组、ML385+阿托伐他汀组，每组各8只。采用腹主动脉缩窄法建立CHF模型：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后打开腹腔、暴露腹主动脉，用5.5号注射器针头紧贴腹主动脉并结扎，而后抽出针头、完成手术；SHAM组进行腹腔麻醉、暴露腹主动脉的假手术操作，但不结扎。术后第2天对相应实验组开始进行干预，阿托伐他汀的剂量为10 mg/kg、ML385的剂量为30 mg/kg，阿托伐他汀用生理盐水配置，ML385用含有10% DMSO的生理盐水配置，给药方式均为灌胃，灌胃体积10 mL/kg，每天1次，连续8周。

1.4.2 心功能的超声检测 给药8周后，采用小动物超声仪进行检测，放置探头、取乳头肌切面、获得超声图像，测量左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短轴缩短率(left ventricular shortening fraction，LVFS)、左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)，左心室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter，LVESD)。

1.4.3 心脏大体形态的观察 完成心功能超声检测后，称体质量，处死大鼠并解剖得到心脏，观察心脏的大体形态并称心脏质量，计算心脏体质量比。

1.4.4 心肌中氧化应激指标的检测 计算心脏体质量比后，取左心室的心肌组织适量，加入组织裂解液进行匀浆，匀浆液在4 ℃、12 000 r/min的条件下离心10 min，分离上清液，采用试剂盒检测蛋白浓度及MDA、8-OHdG、T-AOC浓度，计算每毫克蛋白中MDA、8-OHdG、T-AOC的水平。

1.4.5 心肌中Nrf2、HO-1表达水平的检测 另取左心室心肌组织匀浆后的离心上清液，与上样缓冲液混合后煮沸变性，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳以分离不同分子量的蛋白，而后电转膜至硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜放入5% 脱脂牛奶中室温孵育1 h，洗膜3次后放入1∶1 000稀释的Nrf2、HO-1一抗或1∶5 000稀释的β-actin一抗中4 ℃孵育过夜。次日洗膜3次后放入1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶二抗中孵育1 h，最后在凝胶成像仪中用ECL法显影得到Nrf2、HO-1、β-actin的蛋白条带，根据条带灰度值、以β-actin为内参，计算Nrf2、HO-1的表达水平。

2 结果

2.1 阿托伐他汀对CHF大鼠心功能的调节作用 CHF组的LVEDD、LVESD均高于SHAM组，LVEF、LVFS均低于SHAM组(P<0.05)；阿托伐他汀组的LVEDD、LVESD均低于CHF组，LVEF、LVFS均高于CHF组(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS的比较

2.2 阿托伐他汀对CHF大鼠心脏大体形态的调节作用 CHF组的心脏体质量比、心脏股骨颈比均高于SHAM组(P<0.05)；阿托伐他汀组的心脏质量、心脏体质量比均低于CHF组(P<0.05)。见表2。

2.3 阿托伐他汀对CHF大鼠心肌中氧化应激指标的调节作用 CHF组心肌中MDA、8-OHdG的水平均高于SHAM组，T-AOC的水平低于SHAM组(P<0.05)；阿托伐他汀组心肌中MDA、8-OHdG的水平均低于CHF组，T-AOC的水平高于CHF组(P<0.05)。见表3。

表2 3组大鼠心脏质量、心脏体质量比的比较

表3 3组大鼠心肌中MDA、8-OHdG、T-AOC的比较

2.4 阿托伐他汀对CHF大鼠心肌中Nrf/HO-1通路的调节作用 CHF组心肌中Nrf2、HO-1的表达水平低于SHAM组(P<0.05)；阿托伐他汀组心肌中Nrf2、HO-1的表达水平高于CHF组(P<0.05)。见图1。

注：A，3组间Nrf2表达的比较；B，3组间HO-1表达的比较。

表4 3组大鼠心肌中Nrf2、HO-1表达水平的比较

2.5 ML385对阿托伐他汀激活CHF大鼠心肌中Nrf/HO-1通路的影响 DMSO+CHF组心肌中Nrf2、HO-1的表达水平低于DMSO+SHAM组(P<0.05)；DMSO+阿托伐他汀组心肌中Nrf2、HO-1的表达水平高于DMSO+CHF组(P<0.05)；ML385+阿托伐他汀组心肌中Nrf2、HO-1的表达水平低于DMSO+阿托伐他汀组(P<0.05)。见图2。

注：A，4组间Nrf2表达水平的比较；B，4组间HO-1表达水平的比较。

表5 4组大鼠心肌中Nrf2、HO-1表达水平的比较

2.6 ML385对阿托伐他汀改善CHF大鼠心功能的影响 DMSO+CHF组的LVEDD、LVESD均高于DMSO+SHAM组，LVEF、LVFS均低于DMSO+SHAM组(P<0.05)；DMSO+阿托伐他汀组的LVEDD、LVESD均低于DMSO+CHF组，LVEF、LVFS均高于DMSO+CHF组(P<0.05)；ML385+阿托伐他汀组的LVEDD、LVESD均高于DMSO+阿托伐他汀组，LVEF、LVFS均低于DMSO+阿托伐他汀组(P<0.05)。见表6。

表6 4组大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS的比较

2.7 ML385对阿托伐他汀改善CHF大鼠心脏大体形态的影响 DMSO+CHF组的心脏质量、心脏体质量比均高于DMSO+SHAM组(P<0.05)；DMSO+阿托伐他汀组的心脏质量、心脏体质量比均低于DMSO+CHF组(P<0.05)；ML385+阿托伐他汀组的心脏质量、心脏体质量比均高于DMSO+阿托伐他汀组(P<0.05)。见表7。

表7 4组大鼠心脏质量、心脏体质量比的比较

2.8 ML385对阿托伐他汀改善CHF大鼠心肌氧化应激的影响 DMSO+CHF组心肌中MDA、8-OHdG的水平均高于DMSO+SHAM组，T-AOC的水平低于DMSO+SHAM组(P<0.05)；DMSO+阿托伐他汀组心肌中MDA、8-OHdG的水平均低于DMSO+CHF组，T-AOC的水平高于DMSO+CHF组(P<0.05)；ML385+阿托伐他汀组心肌中MDA、8-OHdG的水平均高于DMSO+阿托伐他汀组，T-AOC的水平低于DMSO+阿托伐他汀组(P<0.05)。见表8。

表8 4组大鼠心肌中MDA、8-OHdG、T-AOC的比较

3 讨论

冠脉粥样硬化造成的心肌缺血，高血压造成的心脏后负荷增加，扩张型心肌病造成心脏前负荷增加等是引起CHF的常见病因。心肌细胞损害、心脏舒缩功能减退、体循环灌注不足、肺循环淤血是CHF主要的病理生理特征，可引起脏器功能损害、心血管事件发生风险增加，临床危害大、需要进行积极防治。阿托伐他汀是心血管领域常用的药物，具有调脂、稳定斑块、降低心脑血管疾病发生风险的作用。近些年，有临床研究发现，阿托伐他汀用于CHF的治疗对患者心功能具有改善作用[7-8]，相应的基础研究也在心肌梗死模型[6]、糖尿病心肌病模型[9]中发现阿托伐他汀对心功能的改善作用。本研究将CHF大鼠为对象，旨在探究阿托伐他汀治疗CHF的作用及机制。

腹主动脉缩窄术是通过增加心脏收缩后负荷建立CHF模型的常用方法[10-11]，本研究通过心超检查观察到LVEDD、LVESD增加的心腔扩大表现及LVEF、LVFS降低的心脏舒缩功能减退表现，同时通过心脏大体形态的观察发现心脏质量及心脏体质量比均增加，符合CHF发病的病理生理特征，也与既往研究[10-11]中腹主动脉缩窄术建立CHF动物模型的特征一致。在进行腹主动脉缩窄术后给予阿托伐他汀灌胃8周，结果发现阿托伐他汀干预使CHF大鼠心腔扩大及心脏舒缩功能减退的表现得到改善，并且心脏质量及心脏体质量比降低，表明阿托伐他汀对CHF大鼠的心功能具有改善作用。

本研究将对相关的分子机制进行探索，旨在更加深入认识阿托伐他汀治疗CHF的价值及CHF发病相关的病理生理机制。目前认为，炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等均与CHF发病过程中心肌细胞损害、心室重构等均密切相关，其中氧化应激不仅直接损害心肌细胞，还对炎症反应、细胞凋亡均具有刺激作用[12-14]。多项研究[15-16]将氧化应激作为研究CHF发病机制及治疗手段的关键靶点。本研究在CHF大鼠的心肌中检测到氧化应激产物MDA、8-OHdG水平增加，反映抗氧化的T-AOC水平降低，符合CHF发病过程中氧化应激激活的特征。阿托伐他汀在心血管系统中不仅发挥调脂的药理作用，多项研究也证实阿托伐他汀对心肌细胞、内皮细胞的氧化应激反应具有抑制作用[17-19]。本研究使用阿托伐他汀灌胃对CHF大鼠进行干预后，心肌中MDA、8-OHdG水平降低，T-AOC水平增加，表明阿托伐他汀在CHF的治疗中起到抗氧化作用，这可能是阿托伐他汀改善CHF大鼠心功能的相关机制。

Nrf2/HO-1是在氧化应激中起抗氧化作用的重要通路，Nrf2是一种转录因子，表达增加并向细胞核转移后能够启动HO-1的表达，进而发挥清除自由基、减轻细胞损伤的抗氧化作用。在CHF、心肌梗死、心肌缺血再灌注等病理生理过程中，心肌中Nrf2/HO-1通路均受到抑制，由该通路介导的抗氧化作用减弱[3-5, 20]。本研究也证实CHF大鼠心肌中Nrf2、HO-1的表达降低，经阿托伐他汀灌胃干预后心肌中Nrf2、HO-1的表达增加，这一结果与CHF大鼠心肌中氧化应激激活、阿托伐他汀减轻氧化应激的作用吻合。为了进一步明确阿托伐他汀对CHF大鼠心功能的改善作用及氧化应激的抑制作用与Nrf2/HO-1通路的关系，本研究在阿托伐他汀灌胃的同时加入Nrf2抑制剂ML385，通过使用ML385抑制Nrf2/HO-1通路、降低Nrf2及HO-1表达水平，阿托伐他汀改善CHF大鼠心功能及氧化应激的作用均削弱，表明阿托伐他汀所发挥的生物学作用部分与激活Nrf2/HO-1通路有关。

综上所述，阿托伐他汀对CHF大鼠的心功能具有改善作用，这一作用与激活Nrf2/HO-1通路、减轻氧化应激反应有关。