秋季茶树修剪鲜叶中多酚类物质的提取工艺

李少华，韩锦斌，陈荣冰*，王飞权，冯花，郞岩

(1.武夷学院 旅游学院，福建 武夷山 354300；2.武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300)

我国是茶树的发源地，茶园栽培面积和产量均居世界前列，主要分布于我国长江以南地区。通常茶树每年会经历3～4轮新梢萌发生长，由此加工所得茶叶通常称为春茶、夏茶和秋茶。茶树春梢由于内含物丰富，比例协调，常作为名优茶生产原料，是茶农的最主要经济来源[1]，夏秋茶梢由于品质较差，经济价值较低弃采现象普遍[2]，而为保证来年春茶的优质高产，通常在秋季对茶树进行修整及田园管理，茶树修剪可增加茶树经济年龄，又能促进新梢发育、复壮重组树冠[3]。

茶叶在我国的药用历史已有上千年。《神农本草经》《新修本草》《太平圣惠方》《食疗本草》《令媛要方》《和剂局方》等医书均有关于茶叶功效的记载。茶叶的主要生物活性成分是茶多酚(teapolyphenols，TP)，现代药理学研究表明，茶多酚具有抗动脉粥样硬化、抗氧化、防癌、抑菌、抗辐射、抗病毒、解毒、降血脂和血糖、抗衰老等方面作用[4-9]，具有较高的应用价值。夏秋茶产量约占全年茶叶总产量60%，原料丰富，且夏秋季节由于光照较长，气温较高，茶树体内碳代谢较为旺盛，多酚物质积累较高[10]，因此将茶树修剪废弃物作为活性物质提取原料，既不增加茶农工作量，又可提高茶树资源利用率，还能增加茶农收益。当前茶多酚的主要制备方法是将干茶副产物粉碎后采用有机溶剂提取制备而得，而将茶树修剪鲜叶作为直接提取原料，尚未见报道。

以秋季茶树修剪鲜叶为原料，采用多重响应面法和Box-Behnken设计，考察提取变量与茶多酚提取率的关系，确定茶树修剪鲜叶中茶多酚提取的最佳工艺条件。

1 材料与仪器

1.1 仪器

UV-1880型紫外分光光度计，上海美普达仪器有限公司；Sartorius BS224S电子天平，赛多利斯公司；JYL-Y92S破壁机，九阳股份有限公司；HWS-26型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；ZFDA5040A型鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；Unicen MR离心机，德国Herolab公司；Kertone Lab MINI-DI超纯水机，湖南科尔顿水务有限公司。

1.2 材料

没食子酸对照品，批号：M-017-181216，成都瑞芬思生物科技有限公司；茶鲜叶，武夷学院武夷茶学科教园10月水仙茶树修剪鲜叶，经福建省农科院茶叶研究所陈荣冰研究员鉴定；福林酚、碳酸钠等试剂，购于国药集团化学试剂有限公司均为分析纯；实验用水为蒸馏水。

2 实验方法

2.1 茶叶匀浆的制备

将修剪下来的茶叶，摘取新梢部分，置于微波炉中杀青5min，加适量水放入破壁机中研磨成茶浆，将制好的茶叶原浆放入磨砂广口瓶中，置于-20℃的条件下保存备用。

2.2 没食子酸标准曲线的建立

精确称取0.110 g的没食子酸，将其溶解并定容至100mL，摇匀得没食子酸储备溶液。分别移取0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL储备液定容至100mL，分别移取1mL定容好的溶液，加入5 mL福林酚（10%），摇匀后分别再加入4 mL碳酸钠（7.5%），摇匀，静置60min，在765 nm波长下测吸光度。以吸光光度为纵坐标，对照品溶液的浓度(ug/ml)为横作标，得线性回归方程y=0.009x+0.106，R2=0.999,线性关系良好。

2.3 茶多酚含量的测定

参考GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[11]，取试液1 mL，加入10% 5 mL福林酚溶液摇匀，5 min后加入7.5%4 mL碳酸钠溶液，静置60min，在765 nm波长下测吸光度。按照下述公式计算提取率。

式中：As为样品吸光度；Vs为提取液体积；d为稀释倍数；Slstd为标准曲线斜率；m为干物质含量；ms为茶浆干物质质量。

2.4 提取工艺试验

设置不同的乙醇体积分数、提取温度、提取时间、料液比、提取次数，观察不同因素对提取率的影响。在单因素实验基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[12-16]，A（乙醇体积分数）、B（提取时间）、C（提取次数）、D（料液比）为自变量，以茶多酸提取率（%）为响应值，设计四因素三水平的响应面分析试验。试验数据使用Design-Expert软件进行分析，并得到响应面分析图和方差分析表。试验因素及水平见表1。

表1 Box-Behnken因素水平和编码Tab.1 Box-behnken factor levels and coding

3 实验结果与分析

3.1 提取条件对茶多酚提取效果的影响

3.1.1 乙醇浓度的影响

取茶叶原浆，摇匀，精密称取15份1 g的茶叶原浆，每三份茶浆为一组。分别加入不同体积分数的乙醇水溶液20 mL（0%，30%，50%，80%，100%）在90℃的水浴锅中加热提取30 min（每隔10 min充分摇匀），其中无水乙醇组采用90℃水浴回流方式提取。将加热提取好的溶液置于离心机中5 000 r/min离心5min。考察乙醇浓度对鲜茶叶中茶多酚提取效果的影响。茶多酚的提取结果见图1，当乙醇体积分数提高时，提取效果呈现上升的趋势，但增幅趋缓，并在乙醇体积分数为80%的时候到达最高。呈现此趋势的原因可能为：茶多酚易溶于乙醇，在没有极性有机溶剂的情况下浸出率比较低，当乙醇的体积分数增加时，有利于茶多酚的进一步浸出，但溶液里乙醇含量越来越高，也会促进色素等亲脂性成分的溶出，使得茶多酚溶出受到少量影响。故80%～100%的乙醇体积分数较为适合。

图1 乙醇体积分数对茶多酚提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of tea polyphenols

3.1.2 提取温度的影响

取茶叶原浆，摇匀，精密称取24份1 g的茶叶原浆，每三份茶浆为一组。分别加入20mL体积分数为80%的乙醇溶液，分别于30、40、50、60、70、80、90、100℃水浴锅中提取30min（每隔10min充分摇匀），将加热提取好的溶液置于离心机中5 000 r/min离心5min。考察提取温度对鲜茶叶中茶多酚提取效果的影响。结果见图2，在50～80℃时茶多酚提取效果接近，提取温度提高到90℃有较大的提高，随着温度的进一步上升，茶多酚的提取效果略有下降。温度提高有利于溶剂分子的运动，促进溶质的溶出，但茶多酚性质较为活泼，温度过高容易被破坏，故90℃的提取温度较为适合。

图2 提取温度对茶多酚提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of tea polyphenols

3.1.3 提取时间的影响

取茶叶原浆，摇匀，称取15份1 g的茶叶原浆，每三份为一组，精准称定。分别加入20 mL，80%乙醇溶液，置于90℃水浴锅中水浴加热，分别提取15、30、45、60、90min（每隔10min充分摇匀），将加热提取好的溶液置于离心机中5 000 r/min离心5min。考察提取温度对鲜茶叶中茶多酚提取效果的影响。由图3可知，当提取时间从15min延长至30min时，茶多酚的提取效果显著上升，随后进入平台期，可能的原因是所用原料为茶浆，溶剂渗透效果较好，茶多酚提取较快达到平衡状态，从效率提升的角度，因此提取时间为以30～60min为宜。

图3 提取时间对茶多酚提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of tea polyphenols

3.1.4 料液比的影响

取茶叶原浆，摇匀，称取18份1 g的茶叶原浆，每三份为一组，精准称定。分别加入不同体积的80%乙醇溶液（10、15、20、30、40、50mL），分别置于水温为90℃的水浴锅中加热提取30 min（每隔10 min充分摇匀），将加热提取好的溶液置于离心机中5 000 r/min离心5 min。考察料液比对鲜茶叶中茶多酚提取效果的影响。由图4可知，料液比增加的同时，茶多酚的提取效果呈上升趋势，其中从1∶10到1∶30时增长较快，而1∶30到1∶50进入平缓期。这可能是溶剂的增加有利于降低浓度，促进茶多酚的扩散，增强了提取效果。因此料液比为1∶30～1∶50为宜。

图4 料液比对茶多酚提取率的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of tea polyphenols

3.1.5 提取次数的影响

取茶叶原浆，摇匀，称取9份1 g的茶叶原浆，每三份为一组，精准称定。分别加入20mL，80%乙醇溶液，置于水温为90℃的水浴锅中加热提取30min，分别提取1、2、3次（每隔10min充分摇匀），将加热提取好的溶液置于离心机中5 000 r/min离心5 min，多次提取的试验组将每次离心得到的上清液混合，得最终上清液（多次提取需将清液倒出，用茶样残渣进行同等条件的重复提取）。考察提取次数对鲜茶叶中茶多酚提取效果的影响。结果见图5，提取次数的增加茶多酚提取少量提升，因此提取1～3次为宜。

图5 提取次数对茶多酚提取率的影响Fig.5 Effect of extraction times on extraction rate of tea polyphenols

3.2 鲜茶叶茶多酚提取工艺响应面优化分析

响应面试验共有29个试验点，对表2中的数据依据响应面分析方法，进行回归拟合，得到回归方程为：

表2 Box-Behnken试验设计与结果Tab.2 Box-behnken design and results

式中：Y为茶多酚提取率，A为乙醇体积分数，B为提取时间，C为提取次数，D为料液比。

从多项式系数可以看出，影响秋茶鲜叶中茶多酚提取率因素排序为：D＞A＞B＞C。

从方差分析分析表3可看出，回归模型P＜0.01，失拟项P＞0.05，表明该回归方程的拟合程度较好，误差较小，可用于对秋茶鲜叶中茶多酚提取率进行预测。表中仅C项和BC项因子对茶多酚提取有差异具有统计学意义（P＜0.01），其中C为负显著，其余各因素对茶多酚提取差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

表3 方差分析结果Tab.3 Analysis of variance results

响应面分析法图是特定响应值与对应因素构成的一个三维空间，直观地反应出各因素对响应值的影响，可以分析出他们的相互作用。

由图6可知：料液比的增加，茶多酚的提取效果提升明显；乙醇体积分数的提高，茶多酚的提取效果提升明显；随取次数的增加茶多酚的提取效果下降比较明显；提取时间的增加，茶多酚的提取效率随之下降，响应值变化较小。

图6 响应曲面图Fig.6 Response surface

3.3 验证试验

经过Design-Expert软件分析，可以得出鲜茶叶中茶多酚提取的最佳条件为料液比1∶50、提取时间为30min、乙醇体积分数为80%、提取次数为1次，在此条件下，茶多酚的提取率可达到95.12%。按照此参数进行验证试验，结果茶多酚的提取率达到94.85%，含量为158.40 mg/g。与理论的预测值95.12%，相对误差仅为0.27%。说明此预测模型可信度较高。

4 结论

在单因素实验基础上，选择料液比、提取时间、乙醇浓度、提取次数为考察因素，采用多重响应面法优化茶多酚的提取工艺条件。结果表明，采用Box-Behnken法建立鲜茶叶中茶多酚提取工艺模型得率高，并能很好的预测试验结果。以茶树修剪枝作为提取原料，深入开展茶多酚提取分离及其生物活性的研究,开发出能防治肿瘤、心血管疾病等具有医疗保健作用的药品、食品不仅经济效益相当可观，同时也能为保障人民健康做出巨大贡献。