商品山茶油中总多酚组分测定及抗氧化活性分析

2022-05-21范俐徐晓斌许祯毅陈珊珊

武夷学院学报 2022年3期

范俐，徐晓斌，许祯毅，陈珊珊

（武夷学院茶与食品学院，福建南平 354300）

山茶油具有抗氧化活性作用，预防心血管硬化、降血压、降血脂、抗菌，抗紫外线，防止晒斑及减轻皱纹等功效[1]。

油茶多酚是油茶籽中最重要的次生代谢产物之一，与油茶籽油的品质、色泽和氧化稳定性等紧密相关，具有抗氧化活性，也与保健功效密切相关[2-3]。山茶油中多酚物质种类、含量与其种质资源[4]、气候条件[5]、制油工艺[6]、精制步骤[7]等密切相关。多酚物质由于极性较强，大部分残留在饼粕中，仅部分溶解或分散在油脂中，籍一定的分配系数存在于油脂中，或以极性较弱的复杂酚类溶解于油脂中[8]。近年来，由于大众认同山茶油保健功能，市售的山茶油品牌越来越多，经过精练加工的商品油，多酚含量及抗氧化性是否降低，针对这一问题国内外均未见报道。

选取超市中金龙鱼油茶籽油、沈郎乡山茶籽油为样品，采用固相萃取提取和福林酚法测定多酚含量；采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率、羟自由基清除率和还原力试验测定山茶油多酚提取物的抗氧化活性；建立LC-MS/MS同时检测23种酚类化合物方法，检测山茶油中酚类化合物组分，为山茶油掺伪鉴别技术研究，开发更高品质的山茶油产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金龙鱼油茶籽油、沈郎乡山茶籽油：永辉超市选购；压榨山茶毛油：浙江省龙泉下圩山茶油种植场提供；二醇基（diol）固相萃取柱。

甲醇：色谱纯，上海展云化工有限公司；正己烷：色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸：分析纯AR，三明市三圆化学试剂有限公司；Trolox：生化试剂BR，上海展云化工有限公司；三氯化铁：分析纯，西陇科学股份有限公司；福林酚、无水碳酸钠、DPPH、没食子酸、硫酸亚铁铵、过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、三氯乙酸、邻二氮菲、铁氰化钾：分析纯，上海展云化工有限公司；表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、儿茶酸、表儿茶素、芦丁、3,4-亚甲二氧基苯酚、异鼠李素、酪醇、高藜芦酸、邻苯二甲酸、绿原酸、槲皮素、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、羟基酪醇、羟基酪醇醋酸酯、肉桂酸、阿魏酸、芥子酸、松脂酚、芹菜素、木犀草素等标准品：HPLC级，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SCIEX QTRAP®4500液质联用仪：美国AB Sciex公司；可见分光光度计：MAPADA V-1100D，上海美普达仪器有限公司；固相萃取装置：OVP-30，冠森生物科技有限公司；氮吹仪：UGC-12M，中国优晟联合科技有限公司；台式高速冷冻离心机：Microfuge 20R，Beckman Coulter公司；涡旋振荡器：Vortex-Genie 2，美国Scientific Industries公司；恒温培养振荡器：ZHWY-103D，上海智城分析仪器制造有限公司；高速离心机：HC-2514，安徽中科中佳科学仪器有限公司；超级恒温水浴锅：HH-601，宝曼科学仪器设备有限公司；电子天平：BSA224S，赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山茶油中多酚的萃取山茶油中多酚的萃取采用二醇基固柱萃取法。

1.3.2 山茶油中多酚含量的测定采用福林酚法测定山茶油中多酚含量。以没食子酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。取1mL样品溶液，在750 nm波长条件下测定吸光度，进行3次平行实验，根据标准曲线计算样品中总多酚含量，取平均值。计算公式如下

式中：X为每千克植物油中多酚的含量（mg）；C为根据标准曲线查得多酚浓度（μg/mL）；D为样品定容后的稀释倍数；2为洗脱液蒸干后定容体积（mL）；m为试样质量（g）。

1.3.3 DPPH自由基清除能力测定

将样品多酚萃取液稀释至不同浓度，分别取1mL溶液依次添加甲醇、DPPH溶液1mL，充分混匀后避光反应0.5 h，于517 nm波长处检测OD值，横坐标为多酚浓度、纵坐标为DPPH清除率（%），平行测定3次，计算DPPH自由基清除率，以维生素E（VE）作为对照。

式中：S为DPPH自由基清除率；Ai为样品吸光值；Aj为甲醇水代替DPPH溶液的吸光值；A0为甲醇水代替样品的吸光值。

1.3.4 羟自由基清除能力测定

分别配制同浓度的山茶油多酚溶液。取0.3 mL 7.5 mmol/L邻二氮菲溶液于试管中，依次加入1 mL pH值为8.2的Tris-HCL溶液和1mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.3 mL 7.5 mmol/L硫酸亚铁铵溶液，混匀后，加入1 mL 7.5 mmol/L H2O2溶液，于37℃恒温水浴中准确反应60 min后，在510 nm快速测其吸光值，所得的数据为损伤管的吸光值A2。未损伤管以1 mL蒸馏水代替损伤管中1 mL 7.5 mmol/L H2O2溶液，操作方法同损伤管，可测得510 nm未损伤管的吸光值A1。样品管以1 mL样品代替损伤管中的1 mL蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得510 nm样品管的吸光值A3，平行测定3次，以维生素E(VE)溶液为对照组计算羟自由基的清除率。

式中：M为羟自由基的清除率；A1为未损伤管的吸光值；A2为损伤管的吸光值；A3为样品管的吸光值。

1.3.5 还原能力测定

采用普鲁士兰法测定还原能力[15]。在700 nm测定吸光值，平行测定3次，取平均值，吸光值越大则还原能力越强。

1.3.6 多酚化合物LC-MS/MS定量分析

1.3.6.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅢ2.0 mm×75 mm；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；柱温箱：40℃；流速：0.300mL/min；进样量：5.00μL；梯度洗脱，流动相A的比例：0～0.3 min，80%；0.3～2.0 min，80%；2.0～4.0min，10%；4.0～4.2 min，10%；4.2～6.0 min，80%；6.0min，80%。

1.3.6.2 质谱条件

扫描模式：负离子；气帘气（CUR）：30 psi（1 psi=6.895 kpa）；碰撞气（CAD）：Medium；离子喷雾电压（IS）：-4500 V（负离子）；离子源温度（TEM）：550℃。

1.3.6.3 酚类化合物的线性关系

取标准品先配制储备液适量，再用甲醇稀释配制系列梯度浓度的标准品溶液，按“1.3.6.1与1.3.6.2”项条件进行测定。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 23种多酚组分的线性关系Tab.1 Linear relationship of 23 polyphenols components

2 实验结果与分析

2.1 山茶油中总多酚含量的测定

2.1.1 绘制标准曲线

多酚含量测定的标准曲线线性回归方程为y=0.016 19x+0.008 71，R2=0.995 4，具有较好的线性关系。所得标准曲线如图1。

图1 多酚标准曲线（没食子酸当量计）Fig.1 Polyphenol standard curve(gallic acid equivalent meter)

2.1.2 两种商品山茶油中总多酚含量

由表2可知，两种商品山茶油中，每千克金龙鱼茶籽油总多酚（以没食子酸当量计）含量为（6.88±0.13）mg，每千克沈郎乡山茶籽油为（8.60±0.06）mg，沈郎乡高于金龙鱼的25%，两者均低于压榨山茶毛油（26.07±0.47）mg，说明两种商品山茶油多酚含量仍有提高空间，需要进一步改进加工工艺。

表2 两种市售山茶油中总多酚含量Tab.2 Total polyphenols content in two kinds of commercial camellia oils

2.2 抗氧化性活性测定结果

2.2.1 DPPH自由基清除能力

根据图2可知，DPPH自由基清除率随着山茶油多酚浓度的增大而不断提高。沈郎乡山茶油多酚、金龙鱼山茶油多酚、维生素E(VE)的DPPH自由基消除率的IC50分别为1.647、1.722、3.195 mg/L，对DPPH自由基清除能力大小依次为：维生素E(VE)＞沈郎乡＞金龙鱼。

图2 两种市售山茶油中多酚的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging rate of polyphenols in two kinds of commercial camellia oils

2.2.2 羟自由基清除能力

根据图3可知，羟自由基清除率随着山茶油多酚浓度的增大而不断提高，沈郎乡山茶油中多酚的羟自由基清除率接近于金龙鱼山茶油。维生素E(VE)、沈郎乡山茶油多酚和金龙鱼山茶油多酚羟自由基IC50分别为2.347、1.030、1.161 mg/L，对羟自由基清除能力大小依次为：沈郎乡＞金龙鱼＞维生素E(VE)。

图3 两种商品山茶油中多酚的羟自由基消除Fig.3 Hydroxyl radical elimination rates of polyphenols in two commercially available camellia oils

2.2.3 还原力分析

根据图4可知，还原力随着山茶油多酚浓度的增大而不断提高。维生素E(VE)、沈郎乡山茶油多酚和金龙鱼山茶油多酚的还原力EC0.2（吸光值为0.2时的多酚有效浓度）分别为3.45、3.27、22.38 mg/L，还原力大小依次为：沈郎乡＞维生素E(VE)＞金龙鱼。

图4 两种商品山茶油中多酚的还原力Fig.4 Reducing power of polyphenols in two kinds of commercial camellia oils

2.2.4 多酚组分的分析

根据表3，两种商品山茶油共检测出10种酚类化合物，分别为：表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、芦丁、3,4-亚甲二氧基苯酚、高藜芦酸、松脂酚、邻苯二甲酸、绿原酸、香草、酸酪醇；其中金龙鱼山茶油未检出香草酸，而沈郎乡山茶油未检出酪醇。每千克沈郎乡山茶油中含量较多的酚类化合物分别为：松脂酚（1 888.30±136.13）μg、高藜芦酸（253.92±1.00）μg、3,4-亚甲二氧基苯酚（115.08±1.47）μg；每千克金龙鱼山茶油中含量较多的酚类化合物分别为：高藜芦酸（186.06±0.28）μg；3,4-亚甲二氧基苯酚（107.14±1.29）μg。