心肌缺血再灌注损伤对围绝经期大鼠认知功能和雌激素水平的影响

陈 焱,韩冲芳,杨文曲,赵雪丽,常 鑫

(1山西医科大学麻醉学院麻醉教研室,太原 030001;2山西医科大学第三医院,山西白求恩医院,山西医学科学院,同济山西医院麻醉科;*通讯作者,E-mail:hanchongfang2003@foxmail.com)

雌激素可以舒张冠脉、降低血压和调节胆固醇代谢,从而改善冠脉微循环并降低冠脉硬化的风险[1-3]。由于雌激素水平降低,围绝经期女性冠心病发病率显著增加[4]。及时恢复心肌血流灌注是治疗冠心病心肌缺血的必要措施。然而在成年雄性大鼠中,心肌再灌注过程不仅会导致心肌损伤,也会损伤脑组织[5]。研究认为,雌激素可通过减轻心肌再灌注损伤引发氧化应激反应,减少梗死面积并改善心功能[6]。雌激素也可以抑制神经炎症反应的激活、维持神经元活性和功能,对创伤性和缺血性脑损伤起到保护作用[7,8]。心肌缺血再灌注损伤对围绝经期大鼠认知功能和雌激素水平的影响尚不清楚,本研究拟探讨心肌缺血再灌注损伤对围绝经期大鼠认知功能和雌激素水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择

雌性健康SD大鼠60只,15～20月龄,由山西医科大学实验动物中心提供。大鼠均在(23±3)℃洁净干燥、水与食物充足的环境中适应7 d,昼夜各12 h。造模前禁食12 h,不禁水。

1.2 实验动物分组与心肌缺血再灌注模型的制备

采用随机数字表法分为3组(n=20):对照组(Con组)、假手术组(sham组)、心肌缺血再灌注组(MIR组)。MIR组大鼠在自制麻醉箱中以3%七氟醚(批号:0Z072,Maruiahi Pharmaceutical Co,中国深圳)进行麻醉诱导5 min,以2%七氟醚维持麻醉2.5 h。行经口气管插管,连接ALC-V8动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)行机械通气(频率60次/min、潮气量20 ml/kg、吸/呼比1 ∶2),行股动脉穿刺置管术并通过BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)行心电、血压监护。经胸骨左缘3～4肋间开胸,打开心包,在左心耳根部与肺动脉圆锥之间用6-0丝线结扎冠状动脉左前降支。30 min后松开丝线,恢复灌注120 min后缝合组织关闭胸腔,采用荷包缝合法缝皮。sham组仅穿线不结扎;Con组不加处理。

1.3 实验方法

1.3.1 Morris水迷宫试验检测大鼠学习、运动能力与认知功能 三组大鼠造模前连续6 d行定向航行试验,每日3次。平台固定于SE象限。引导大鼠在平台上学习30 s后,随机将其放入任意象限。通过摄像系统化软件自动跟踪记录其各时日游泳速度和潜伏期。如60 s内大鼠未找到平台,则潜伏期记为60 s,并再次引导大鼠在平台学习15 s。定向航行试验中游泳速度反应大鼠造模前运动能力,潜伏期反应大鼠造模前学习、记忆认知功能。

造模1 d后行空间探索试验。撤去平台,将软件设置为识别原平台所在位置。将大鼠随机放入任意象限,跟踪记录大鼠游泳速度和穿越原平台的次数。空间探索试验中游泳速度反应大鼠造模后运动能力,穿越平台次数反应大鼠造模后记忆认知功能。

1.3.2 ELISA法检测大鼠血清cTnI浓度 MIR组大鼠于结扎冠状动脉左前降支前和造模后分别抽取股动脉血5 ml,室温静置2 min,4 ℃ 3 500 r/min离心5 min。取上清液,分装,于-80 ℃冰箱保存。按照cTnI ELISA定量检测试剂盒说明书(泉州市睿信生物科技有限公司,RX302234R)测定450 nm波长下的吸光度,绘制标准品曲线,计算大鼠心肌缺血前和造模后血清cTnI浓度。

1.3.3 ELISA法检测大鼠血清雌激素浓度 Con组和sham组大鼠于造模后抽取股动脉血3 ml,室温静置后,4 ℃ 3 500 r/min离心5 min,取上清液,同时取MIR组大鼠造模后上清液样本,按照E2 ELISA定量检测试剂盒说明书(泉州市睿信生物科技有限公司,RXJ302812R),绘制标准品曲线,计算各组大鼠造模后血清雌激素水平。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 MIR组血清cTnI浓度配对分析

造模后血清cTnI浓度较结扎冠状动脉左前降支前血清cTnI浓度显著升高[(1.95±0.33)μg/Lvs(0.59±0.16)μg/L,t=17.06,P<0.05]。

2.2 水迷宫试验结果

2.2.1 定向航行试验结果 3组间大鼠各日游泳速度和潜伏期比较差异均无统计学意义(P>0.05,见图1,2),各组大鼠潜伏期均逐日缩短。

图1 各组大鼠在定向航行试验中的游泳速度Figure 1 Swimming speed of rats in the place navigation test in each group

2.2.2 空间探索试验结果 Con组、sham组和MIR组大鼠游泳速度分别为(15.60±1.32)cm/s、(16.02±1.30)cm/s和(15.78±1.32)cm/s,三组间比较差异无统计学意义(P>0.05,见图3)。Con组、sham组和MIR组穿越平台次数分别为(18.65±4.16)次、(13.00±3.45)次和(6.85±3.73)次;与Con组相比,sham组和MIR组大鼠穿越平台次数显著减少(P<0.05);与sham组相比,MIR组大鼠穿越平台次数显著减少(P<0.05,见图4)。

图2 各组大鼠在定向航行试验中的潜伏期Figure 2 Latency of rats in the place navigation test in each group

图3 各组大鼠在空间探索试验中的游泳速度Figure 3 Swimming speed of rats in the space navigation test in each group

与Con组相比，*P<0.05;与sham组相比，#P<0.05图4 各组大鼠在空间探索试验中穿越平台次数Figure 4 Times of crossing the platform of rats in the place navigation test in each group

2.3 造模后各组大鼠雌激素水平

Con组、sham组和MIR组大鼠造模后雌激素水平分别为(87.70±18.62)pg/ml、(90.00±16.07)pg/ml和(94.82±20.35)pg/ml,差异无统计学意义(P>0.05,见图5)。

图5 各组大鼠造模后雌激素水平Figure 5 Levels of estrogen after the modeling in each group

3 讨论

本研究参照文献[9]采用经典的方法结扎冠状动脉左前降支30 min再灌注120 min制备围绝经期大鼠心肌缺血再灌注模型,并通过心肌损伤的高特异性和高敏感性标志物血清cTnI检验模型制备情况,结果表明再灌注后血清cTnI浓度较结扎前显著上调,提示围绝经期大鼠心肌缺血再灌注模型制备成功。

自围绝经期开始,雌激素水平不断下降使其介导的心血管保护作用也逐渐减弱,女性冠心病发病率随之显著上升,且自然绝经早期更易罹患冠心病[10,11]。尽快恢复冠脉血流灌注是冠心病治疗措施的核心目标。而心肌再灌注过程不仅会加重心肌组织损伤、损害心功能,还会导致语言、记忆、认知速度与执行功能等认知功能下降[12,13]。研究表明,心肌缺血再灌注损伤可以引发成年雄性大鼠空间记忆障碍和长时程增强受损等海马依赖性认知障碍[13,14]。心肌缺血再灌注损伤是否会对围绝经期大鼠认知功能造成相似的损伤,尚未得到证实。本研究通过Morris水迷宫定向航行试验和空间探索试验分别评价心肌缺血再灌注损伤前后围绝经期大鼠海马依赖性空间学习能力和记忆水平,判断心肌缺血再灌注损伤对围绝经期大鼠认知功能的影响。定向航行试验结果显示,各组大鼠每日游泳速度和潜伏期均无显著差异,表明各组大鼠学习和运动能力相仿;潜伏期呈现逐日缩短的趋势,提示各组大鼠均对平台位置产生了相对明确的记忆,排除了各组大鼠造模前学习与运动能力差异对造模后水迷宫试验结果的影响。空间探索试验结果显示,各组大鼠造模后运动能力仍相仿而MIR组大鼠穿越平台次数显著减少,表明心肌缺血再灌注损伤引起了围绝经期大鼠海马依赖性认知功能下降。

雌二醇是活性最强的雌激素,可以维持缺血再灌注后心肌细胞线粒体膜电位,减少ROS生成,促进心功能恢复,也可以与中枢神经系统中相应受体结合,提高与记忆和执行功能有关脑区的神经元突触发生和可塑性调节,从而促进记忆形成[6,15]。研究表明,雌激素缺乏会降低雌鼠海马突触蛋白水平,引发空间学习和记忆缺陷[16]。为探究心肌缺血再灌注损伤是否通过改变雌激素水平引发围绝经期大鼠认知障碍,本研究通过ELISA定量检测,发现各组大鼠造模后血清雌激素水平无显著差异,表明心肌缺血再灌注后围绝经期大鼠雌激素水平无显著改变,因而排除了心肌缺血再灌注后内源性雌激素水平对认知功能的影响。研究发现,外源性补充雌二醇可以减轻继发性脑损伤,改善认知功能[17,18]。由此推测,虽然心肌缺血再灌注损伤诱发认知水平下降的过程不影响雌激素水平,但外源性雌二醇补充也可能有利于围绝经期大鼠心肌缺血再灌注后认知功能的改善,后续可对此进一步研究,为临床治疗提供思路。

不足之处:本研究未设置外源性雌二醇补充组或去势大鼠组作对照,未能判断雌激素水平的变化是否影响心肌缺血再灌注后认知水平。

综上所述,心肌缺血再灌注损伤会引发围绝经期大鼠海马依赖性认知功能下降,但不影响围绝经期大鼠血清雌激素水平。