MMP9 介导的活血化瘀药对丹参-川芎反向调节血管新生作用物质基础揭示

侯莉莉，刘海鑫，李青山

（山西中医药大学1.中药与食品工程学院，2.基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室，山西 晋中 030600）

血管生成是新血管形成的过程，可促进胚胎发育，并调节一些关键的生物学过程。异常的血管生成是包括肿瘤转移和动脉粥样硬化斑块形成在内的各种病理过程的基础［1］。多种中药对血管新生有调节作用，如活血化瘀类药物。曾有研究者发现活血化瘀类药物对血管新生具有双向调节的作用［2-5］。临床常用活血化瘀药对配伍丹参和川芎是常见的活血化瘀类中药配伍，研究发现，其对心肌缺血的大鼠有促进血管生成的作用［6，7］，同时对肿瘤模型中的血管生成有抑制血管新生作用［8，9］。在临床上，抑制血管新生可用于肿瘤治疗，而促进血管新生作用则用于缺血性疾病。丹参和川芎配伍之后对血管新生的作用、关键有效成分及调控机制尚不清楚。网络药理学是基于生物学、计算机以及药理等多门科目研究药物作用及机制的新方法［10］，为中药及配伍药方对疾病的作用和机制研究开辟了一条新的道路。本研究运用网络药理学结合实验验证的方法，研究丹参和川芎两种活血化瘀类中药配伍对血管新生的作用及调控机制，对活血化瘀药在临床上的使用有一定的指导作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株

人脐静脉内皮细胞EA.hy926，购买自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 实验试剂

木犀草素（大连美仑生物技术有限公司，货号：MB2172-1）；磷酸盐缓冲液（博士得生物技术有限公司，货号：PYG14040）；DMEM 高糖培养基（Gibco，货 号：12800017）；青-链 霉 素（Hycolne，货 号：J180034）；0.05%胰酶溶液（含EDTA）（博士得生物技术有限公司，货号：PYG0014）；Trizol（Takara，货 号：9108）；反 转 录 试 剂 盒（Takara，货 号：AJ92003A）；PCR 扩 增 试 剂 盒（Takara，货 号：638314）；matrigel 基质胶（BD，货号：356231）

1.3 实验仪器

荧光定量PCR（App Bio，QuantStudio3）；高内涵（MD，ImageXpress Micro4.0）

1.4 实验方法

1.4.1 丹参和川芎的信息收集 在中药系统药理学数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）平台中检索出丹参和川芎两种活血化瘀类中药的有效活性成分［11，12］。由于中药中含有的成分很多，并且各个成分的结构也不尽相同，所以需要根据类药性（DL）和生物利用度（OB）筛选出中药的有效成分［11］进行筛选。OB 是药物的生物利用度，是中药中的有效活性成分治疗疾病的重要指标；DL 代表类药性，是预测有效活性化合物的性质的指标。基于生物利用度OB≥30%，类药性DL≥0.18 的条件，筛选出丹参和川芎两种药物的有效数据。通过Swiss Target Prediction 网 站 预 测 丹 参 和 川 芎 的 靶 点［13］，以Probability≥0.6 为 条 件［14，15］，筛 选 得 到 丹 参 和 川 芎两种药物的有效靶点。

1.4.2 血管新生的靶点分析 在疾病-基因数据库（DisGeNET）（http：//www.disgenet.org/）［16，17］数 据库中以“Inhibit angiogenesis”和“Promote angiogenesis”为关键词检索有关抑制和促进血管新生的靶点，合并后得出与血管新生相关的靶点。

1.4.3 药物-疾病的核心靶点分析 将得到的丹参和川芎两种药物有效成分的靶点合并并删除重复值，将得到的成分靶点与血管新生的靶点取交集得到药物与疾病的交集靶点，并绘制韦恩图。将交集的9 个 靶 点 通 过STRING 数 据 库［18］和Cytoscape3.7.2 软件进行蛋白质之间相互作用关系分析，获得对应的PPI 网络图。

1.4.4 GO 和KEGG 富集分析 将9 个药物-疾病交集靶点导入DAVID 数据库［19，20］中，在P≤0.05 的筛选条件下，筛选得出KEGG 通路和GO 生物通路的最终有效数据。

1.4.5 丹参-川芎-有效成分-血管新生靶点网络图将得到的丹参和川芎两种药物的有效成分及靶点与血管新生的靶点按照一定的格式导入Cytoscape 软件中，构建网络图。

1.4.6 分子对接 在蛋白质银行数据库（PDB，https：//www.rcsb.org/）中收集蛋白质构象。 筛选条件设定如下：（1）通过X-晶体衍射获得蛋白质结构；（2）蛋白质的晶体分辨率小于2.8 Å；（3）分子对接文献中报道的蛋白质结构的优先选择；（4）该生物来自智人。随后，使用SYBYL-X 2.0 进行分子对接计算。

1.4.7 细胞培养 将EA.Hy926 细胞置于DMEM完全培养基（含10% 的胎牛血清，1% 双抗）中培养。细胞培养条件为37 ℃恒温饱和湿度，5% CO2。

1.4.8 RT-qPCR 实验 在定量RT-qPCR 分析中，空白对照组添加含0.1% FBS 的培养基，干预组的细胞培养基中分别加入用含0.1% FBS 的培养基稀释的木犀草素（10-6mol/L），每孔为100 μL 体系，处理24 h 后，按照制造商的说明，使用Trizol 试剂从细胞中提取总RNA。用逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录成cDNA。用扩增试剂盒将cDNA 进行扩增。RT-qPCR 的体系如下：在95 ℃预变性15 min，在95 ℃变性10 s，在60 ℃退火20 s，在72 ℃延伸30 s，40 个循环。用于RT-qPCR 的引物序列如下：MMP-9引物序列：正义链：5'-AGTCCAC-CCTTGTGCTCTTCCC-3'，反义链：5'-TCTGCCAC-CCGAGTGTAACCAT-3'；内参GAPDH 引物序列：正义链：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，反义链：5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。

1.4.9 血管形成分析实验 本实验选择10 代以前的细胞进行体外血管形成分析（Tube Formation Assay）实验，细胞复苏后至少传代两次并于细胞活力旺盛时进行该实验操作。复苏细胞常规接种于25 cm2培养瓶中，待细胞融合至80%～90%时传代至75 cm2培养瓶中继续培养。细胞至少传代两次贴壁后置显微镜下观察，待细胞形态、活力较好并融合至80%～90%时，换成无血清培养基同步化饥饿24 h。BD 基质胶提前4 ℃过夜至少24 h 解冻至液体状态，1 mL 无菌分液器枪头、96 孔黑板、离板机托架提前置于4 ℃冰箱内预冷。Tube Formation Assay 实验操作时（本实验一切操作均需保证无菌），取出冰盒并用照过紫外的冰盒打一盒冰置于超净台内，将96 孔黑板置于冰盒上、BD 基质胶使用时快速从4 ℃冰箱中取出插在冰盒内进行操作。使用分液器插上经4 ℃预冷处理的枪头将基质胶迅速加入各孔底部中间位置（每孔50 μL，本实验一切操作都需避免孔内气泡的产生），铺胶完毕适度震荡96 孔黑板使基质胶铺满整个孔底，平放于4 ℃冰箱内静置15 min。静置完毕后取出黑板置于预冷的离板机托架上（另一个托架的96 孔黑板离心前需配平，于对应孔内添加55 μL ddH2O）离心2 500 r/min，15 min。离心完毕后将去除气泡加有BD 基质胶的黑板置于37 ℃、5% CO2培养箱中平衡30～60 min。胰酶消化收集细胞，细胞计数，以每孔1.5×104个细胞的密度接种于96 孔板中。空白对照组添加含0.1% FBS 的培养基，干预组的细胞培养基中分别加入用含0.1% FBS 的培养基稀释的木犀草素（10-6mol/L），阳性对照组加VEGF（50 ng/mL），每孔为100 μL 体系。一切操作完毕后，将96 孔黑板置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育6～16 h（注意96 孔黑板在放入培养箱内的第一个小时内切勿晃动）。96孔黑板于孵箱中孵育8 h 左右后可于显微镜下观察孔内细胞形成血管腔的情况，观测成腔顺利后用Calcein AM（1 μmol/L）对细胞质进行染色，置于37 ℃、5% CO2培养箱中30 min，PBS 清洗3 次。在高内涵分析仪器下每孔选取中间9 个视野、10 倍物镜进行拍照，计算各孔内血管网眼结构的个数。

1.5 统计学处理

各组实验数据应用GraphPad Prism 5 进行统计，采用方差分析进行显著性检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 丹参和川芎的有效成分及靶点

在中药系统药理学数据库TCMSP 中检索出丹参有3 714 个成分，川芎有602 个成分，经过OB≥30%，DL≥0.18 筛选后结果得出丹参有10 个有效成分，川芎有2 个有效成分。通过Swiss Target Prediction 网站预测成分靶点，去除重复值后得出丹参有50 个靶点，川芎有4 个靶点。

2.2 双向调节血管新生的作用靶点

在DisGeNET 数据库中检索血管新生的靶点，得到526 个促进血管新生和抑制血管新生的靶点。

2.3 丹参/川芎药对中具有双向调节血管新生作用的有效成分-靶点-信号通路-血管新生的作用关系展示

将检索出来的丹参和川芎两种药物的有效成分数据与血管新生的相关靶点数据分析得出疾病和药物的交集靶点，共有9 个。分析得出KEGG 通路主要富集在5 条信号通路，KEGG 通路是丹参-川芎两种药物的靶点富集的通路，代表药物调控相关疾病的信号通路［11］。使用Cytoscape3.7.2 软件制作出丹参/川芎-有效成分-靶点-信号通路-血管新生网络图（图1）。图中的节点表示的是丹参和川芎以及两种药物的有效成分，还有疾病与两种药物的交集靶点等；而其中的边代表的是丹参-川芎与其有效成分、有效成分与交集靶点、疾病与核心通路以及核心通路与交集靶点之间的关系。从该网络图中可以看出，丹参和川芎的5 个活性成分可以调控9 个靶点，而这9 个靶点富集在5 个KEGG 通路上，即每个靶点基因蛋白富集在不同的信号通路，每个有效成分也调控不同的靶点基因蛋白，体现了冠心宁注射液多成分、多靶点、多通路协同双向调节血管新生的作用。

图1 丹参/川芎-有效成分-靶点-信号通路-血管新生网络图Fig 1 Danshen/Chuanxiong-active ingredient-target-signal pathway-angiogenesis network diagram

2.4 丹参/川芎药对中具有双向调节血管新生作用的有效成分和作用靶点

将丹参/川芎药对靶点与双向调节血管新生作用靶点做交集，得出的疾病和药物的交集靶点有9个（图2），分 别 为AR、PARP1、MMP9、MMP2、MMP12、AKR1B10、ABCC1、CDK6、STAT3，即为丹参-川芎治疗血管新生相关疾病的潜在靶点。将9 个靶点在丹参和川芎两种药物的数据中查找，得出靶点对应的有效成分（表1）。用Cytoscape 分析活性成分和靶蛋白之间的相互作用（图3）。单个化合物可以调节多个靶标以触发生物学效应，这可能在调节血管新生中起着至关重要的作用。结果显示，木犀草素的Degree 值最大（Degree=7），可以调控PARP1、MMP9、MMP2、MMP12、AKR1B10、ABCC1、CDK6 等多个靶点，因此木犀草素作为关键有效成分成为后续的深入研究对象。

表1 药物-疾病交集靶点及成分Tab 1 Drug-disease intersection targets and components

图2 丹参/川芎活性成分靶点与血管新生靶点交集Fig 2 The intersection of Danshen/chuanxiong active ingredient targets and angiogenesis targets

图3 丹参/川芎活性成分-靶点网络图（Degree 值越大节点越大）Fig 3 Danshen/Chuanxiong active ingredient-target network diagram（the greater the degree value，the greater the node）

2.5 MMP9 为丹参/川芎药对双向调节血管新生作用的核心靶点

通过丹参/川芎活性成分-靶点网络图得出木犀草素为丹参/川芎药对的影响血管新生作用的关键有效成分，因此将木犀草素作用于血管新生的靶点导入string 网站得出蛋白-蛋白相互作用并利用Cytoscape3.7.2 软件分析得出蛋白-蛋白相互作用网络图（图4）。图4 中显示共有7 个丹参-川芎治疗血管新生相关疾病的关键靶点的互作节点（PARP1、MMP9、 MMP2、 MMP12、 CDK6、 ABCC1、AKR1B10）和12 条边，平均节点为2.89。图中的节点代表药物-疾病交集靶点蛋白，而边代表的是交集靶点蛋白之间的交联关系。此外，图3 中得出MMP9 的Degree 值最高（Degree=10），因此MMP9可能是丹参-川芎影响血管新生作用的核心靶点。

图4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图Fig 4 Protein-protein interaction（PPI）network

2.6 丹参/川芎药对双向调节血管新生作用的主要生物学过程和核心通路

核心通路分析（KEGG）发现丹参/川芎药对双向调节血管新生作用的主要通路富集在5 条信号通路（表2），KEGG 通路是丹参/川芎两种药物的靶点富集的通路，代表药物调控相关疾病的信号通路［11］。丹参和川芎影响的作用通路主要为肿瘤相关通路、肿瘤中的MicroRNAs 等信号通路。其中P值最小的通路为肿瘤相关通路。而且，5 条通路中均含有作用靶点MMP9，因此蛋白与蛋白相互作用分析结果相互佐证了MMP9 为丹参/川芎药对双向调节血管新生作用核心作用靶点。GO 分析得到分子功能13 条通路、生物过程1 条通路和细胞成分8条通路（图5）。GO 功能富集主要涉及胶原分解代谢过程、蛋白质细胞外基质、金属内肽酶活性等与核心靶点MMP9 关系密切（图6）。

图5 KEGG 通路气泡图Fig 5 Bubble diagram of KEGG pathway

图6 GO 生物通路图Fig 6 GO biological pathway diagram

表2 KEGG 通路分析Tab 2 KEGG pathway analysis

2.7 分子对接模拟

基于丹参/川芎活性成分-靶点网络图，PPI 网络和KEGG 信号通路分析，笔者选择MMP9核心靶基因与木犀草素进行分子对接。观察到木犀草素进入了蛋白质的活性口袋（图7）。木犀草素小分子主要与MMP9上的TYR64，ARG116 及GLU117 形成3 个氢键。结合分数是4.1652，达到继续进行验证的条件。

图7 分子对接模拟分析Fig 7 Analysis of target-compound docking simulation

2.8 木犀草素对体外小管形成的影响

为了验证木犀草素对体外小管形成的影响，本研究利用血管形成分析实验方法。与空白组比较，经木犀草素处理后抑制EA.hy926 细胞的体外血管形成，经VEGF 处理后促进EA.hy926 细胞的体外血管形成（图8A）。经过环状结构数目统计，用单因素方差分析检验结果显示：与空白组比较，经木犀草素处理的EA.hy926 细胞的环状结构数目明显减少（P＜0.01），经VEGF 处理的EA.hy926 细胞的环状结构数目明显增高（P＜0.01）（图8B）。实验结果证明木犀草素处理EA.hy926 细胞能够抑制内皮细胞的新血管生成。

图8 体外血管形成分析Fig 8 Tube formation assay

2.9 木犀草素对MMP9 及VEGF-A 的mRNA 表达的影响

为了更深入的分析木犀草素的血管新生作用和作用靶点的转录水平，本研究利用RT-qPCR 实验验证核心有效成分木犀草素是否对核心靶点MMP9的表达有影响。同时VEGF-A作为血管新生的重要靶点［21］，因此验证木犀草素是否对其表达具有影响具有重要意义。用配对t检验结果显示：木犀草素与空白组比较，经木犀草素处理的EA.Hy926 细胞的MMP9表达明显降低（P＜0.01）（图9A）；木犀草素处理的EA.hy926 细胞的VEGF-A的表达同样显著降低（P＜0.05）（图9B）。木犀草素对MMP9与VEGF-A的转录均有抑制作用，给药组MMP9与VEGF-A的表达与空白组相比均降低，表明丹参/川芎药对中主要成分木犀草素通过MMP9反向调节血管新生，与血管形成分析实验结果一致。

图9 RT-qPCR 检测木犀草素对MMP9 及VEGF-A 的mRNA 表达的影响Fig 9 RT-qPCR detection of the effect of luteolin on the mRNA expression of MMP9 and VEGF-A

3 讨论

血管生成是由先前存在的血管形成的新血管的过程，参与了多种生理（例如发育和伤口愈合）过程，也是许多病理过程（包括癌症，感染性关节炎和牛皮癣）的关键因素［22］。它包括以独特的内皮细胞功能为特征的几个步骤，例如增殖，迁移，管腔形成、分化和成熟［23］。每个步骤都涉及多种生长因子、受体和分子，从而影响不同疾病中血管新生的致病性的信号传导［24］。

丹参是我国的一种传统中药材，具有活血化瘀、凉血清心、养血安神等功效［25］。其中丹参粗提物和丹酚酸B（丹参的成分）通过上调VEGF和VEGF-R2基因表达来增强鼠内皮细胞系的血管生成［26］。隐丹参酮可以在体外降低基质金属蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9 的蛋白表达，它还可能通过抑制血管生成相关因素来抑制肿瘤细胞诱导的内皮细胞体外血管生成和大鼠主动脉环体外血管生成［27］。川芎辛散温通，具有活血化瘀、温通经脉的功能［28］。川芎总酚可以通过促进缺血心肌血管新生而改善心功能［29］。中药丹参药材对动脉粥样硬化有最佳疗效，据报道其主要有效成分四甲基吡嗪和芍药苷可减轻动脉粥样硬化。四甲基吡嗪和芍药苷的组合通过抑制VEGF/VEGFR2 和Jagged1/Notch1 信号通路抑制ox-LDL 诱导的HUVEC 血管生成，这可能有助于动脉粥样硬化斑块的稳定性［30］。但是丹参和川芎配伍影响血管新生的作用机制仍不明确。

本文利用网络药理学的方法对丹参和川芎配伍影响血管新生的活性成分、作用靶点、相关通路等方面进行了探讨。筛出丹参有10 个有效成分，川芎有2 个有效成分；丹参有50 个靶点，川芎有4 个靶点。其中木犀草素为最重要的活性成分，木犀草素是多酚类黄酮化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学活性［31，32］。有研究表明木犀草素对血管新生活力具有抑制作用，从而达到抗癌的效果［33］。

在丹参和川芎配伍影响血管新生的蛋白相互作用网络中有7 个节点和24 条边，其中MMP9基因在网络中处于重要的地位，可能是丹参和川芎配伍影响血管新生的重要靶点。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类依赖于锌离子的蛋白酶家族，具有降解细胞外基质的作用。MMP9 是MMP 家族中重要成员，在血管生成和细胞迁移中发挥着重要的作用。MMP9 最早在炎症和某些癌症中被发现其表达上调，在肿瘤的侵袭和转移中的作用与其促进血管新生密切相关［34］。

KEGG 富集分析发现丹参和川芎配伍可以通过影响血管新生进而调节癌症通路。1971 年，福克曼在《新英格兰医学杂志》上提出了一种思考癌症的全新方式。通过应用有效的策略来抑制驱动肿瘤血管生成的关键参与者，从而使肿瘤“饿死”［35］。并提出抗血管生成作为预防癌症的策略，其作为一种治疗癌症的革命性方法成为当今最令人激动的科学探究领域之一［36］。

综上所述，本研究通过网络药理学结合实验验证的方法研究了丹参和川芎配伍影响血管新生的作用机制，发现丹参和川芎配伍可以通过影响血管新生从而达到抗癌的效果，其作用机制可能与MMP9、MMP2 等靶点有关。在网络药理学分析方法的基础上分析两种药物有效成分、靶点蛋白和作用通路结果显示丹参-川芎是通过多靶点、多通路、多成分对血管新生相关疾病发挥作用的。

作者贡献度说明：

侯莉莉：网络药理学，分子对接及PCR 实验部分。刘海鑫：血管形成分析实验部分及指导实验。李青山：实验思路指导。