褪黑素腹腔注射对糖尿病合并脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织损伤的预防作用及其机制

刘雅静，李冰玉，宋文沁，黎梅，刘恋

武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060

糖尿病作为一种全身性系统性疾病，严重影响全身多个重要脏器的结构和功能。高糖可显著增加脑缺血再灌注损伤（CIRI）的发生率和致死、致残率，而CIRI 又会产生应激性高糖进而形成恶性循环［1］。研究表明，糖尿病是CIRI 早期神经功能恶化的重要危险因素之一，持续高糖可加重血管内皮细胞损伤，增加过氧化物与炎性因子的生成，降低氧自由基清除能力，最终导致梗死灶扩大，神经功能受损［2-3］。自噬作为维护细胞网络功能完整、能量代谢平衡的重要内源性保护机制，可将受损的蛋白质及细胞器降解成氨基酸等小分子物质再次利用，以保障机体在特殊状态下生理功能的正常运转［4］。研究显示，糖尿病可激活自噬，但在持续高糖刺激下自噬表达下降，细胞稳态发生改变，进而加重损伤［5］。新近研究证实，SIRT1-BMAL1 通路在昼夜节律、DNA 损伤修复、细胞存活等多项生命活动中发挥关键作用［6］。BMAL1 可直接与自噬蛋白Atg14 启动子中的E-box元件结合增加其表达，同时BMAL1基因敲除加剧了高糖诱导的自噬抑制，导致心肌细胞损伤加重［7-8］。褪黑素是一种内源性合成、分泌的化合物，在大脑和脑脊液中浓度较高，其对包括能量代谢和体质量调节在内的众多生理功能具有广泛影响，并可激活包括SIRT1-BMAL1通路在内的多种信号通路［9］。然而SIRT1-BMAL1 通路介导的自噬在糖尿病CIRI 中的作用尚未阐明，褪黑素是否通过该通路在糖尿病CIRI 中发挥作用尚不清楚。2019 年1 月—2020 年12月，我们通过观察褪黑素糖尿病CIRI小鼠脑组织损伤的预防作用，探讨其作用机制与SIRT1-BMAL1通路介导的自噬的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康雄性C57BL/6 小鼠，6～8 周龄，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养条件：湿度65% ± 5%，温度（25±1）℃，12 h光照/12 h黑暗周期喂养。

1.1.2 药物与试剂 链脲佐菌素（STZ）、TTC 溶液（Sigma，美国），褪黑素（Sigma-Aldrich，美国），SIRT1抑制剂EX527（Selleck，美国），SDS-PAGE 凝胶试剂盒（赛维尔，中国），BCA 蛋白测定试剂盒（爱必信，中国），LC3 抗体（Proteintech，美国），Beclin1 抗体、BMAL1 抗体（Abcam，美国），Atg14 抗体、SIRT1 抗体（CST，美国），乙酰化BMAL1（ac-BMAL1）抗体（Millipore，美国），β-actin、HRP标记的二抗（CST，美国）。

1.1.3 主要仪器 血糖仪（强生，美国），手术显微镜（凤凰COX6100，中国），低温高速离心机（Thermo，德国），电泳仪（Bio-Rad，美国），倒置显微镜（Olympus，日本）。

1.2 糖尿病模型制备 所有小鼠连续5 d腹腔注射1%STZ 50 mg/kg，1周后尾静脉检测随机血糖，以血糖≥16.7 mmol/L 并出现多饮、多尿、体质量减轻症状为造模成功。造模成功后继续饲养4 周，每周进行1次空腹血糖和体质量测定。

1.3 脑缺血再灌注模型制备 采用大脑中动脉栓塞（MCAO）法。小鼠麻醉，暴露左颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA），分别在CCA 近心端和ECA 远心端结扎，在CCA 剪一小口将6-0 线栓由CCA 插到ICA，在稍遇阻力后停止，在CCA 切口上方用丝线将线栓活结固定。缺血1 h 后将线栓取出，随即将CCA上的活结系紧，进行再灌注。

1.4 动物分组与处理 将24 只小鼠随机分为糖尿病假手术组、糖尿病缺血再灌注组、糖尿病缺血再灌注+褪黑素组、糖尿病缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制剂组，每组各6 只。假手术组分离大脑中动脉但不阻断；缺血再灌注组采用MCAO 法建立脑缺血再灌注模型；缺血再灌注+褪黑素组采用MCAO 法建立脑缺血再灌注模型，于缺血即刻和再灌注前腹腔注射褪黑素10 mg/kg；缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑 制 剂组于MCAO 术前5、3、1 d 分别腹 腔 注射SIRT1 抑制剂5 mg/kg，采用MCAO 法建立脑缺血再灌注模型，于缺血即刻和再灌注前腹腔注射褪黑素10 mg/kg。于再灌注24 h后处死各组小鼠。

1.4 脑组织病理检查 采用HE 染色法。取小鼠脑组织，石蜡包埋、切片，依次加入二甲苯、梯度乙醇水化，蒸馏水洗去乙醇，苏木素染色。自来水冲洗，用含1%盐酸的乙醇分色数秒；加入0.6%氨水处理，流水冲洗2 min。将切片置于伊红染色液中染色2 min，用梯度乙醇、二甲苯脱水，中性树胶片，光学显微镜下进行病理学分析。

1.5 脑梗死体积测定 采用TTC 染色法。取小鼠脑组织，-20 ℃速冻30 min后，沿冠状位切成4～6张薄片，将切好的组织薄片依次放入TTC 溶液中，37 ℃避光染色30 min。待组织出现深红色后，加入固定液固定24 h。取出组织薄片，用滤纸吸干固定液，拍照，图像使用NIH Image J 软件测定大脑皮层及梗死体积。整个梗死体积由大脑切片梗死体积相加获得，最后结果以梗死体积占对侧大脑皮层体积的百分比表示。

1.6 脑组织自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg14和SIRT1-BMAL1 通路相关蛋白SIRT1、BAML1、ac-BMAL1 检测 采用Western blotting 法。取100 mg缺血脑组织，BSA 法测定蛋白浓度，配置SDS-PAGE凝胶后电泳，待电泳结束后PVDF 转膜，TBST 封闭2 h 后 分 别 加 入LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg14、SIRT1、BAML1、ac-BMAL1 一抗（稀释浓度均为1∶1000）4 ℃孵育过夜。次日加入相应的二抗，室温孵育2 h。使用医用X射线胶片压片后，依次放入显影液显影、定影液定影，晾干并扫描胶片，用BandScan 凝胶分析软件分析胶片的灰度值。

1.7 统计学方法 采用SPSS18.0 统计软件。正态分布检验采用Shapiro-Wilk 法，符合正态分布的计量资料以-x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠脑组织病理检查结果 假手术组神经细胞胞膜完整，胞质丰富，核圆形，结构清晰；与假手术组相比，缺血再灌注组小鼠神经细胞数量减少，胞体皱缩，胞质疏松并伴有空泡形成，胞核溶解或消失；与缺血再灌注组相比，缺血再灌注+褪黑素组上述改变减轻；与缺血再灌注+褪黑素组相比，缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制剂组上述改变加重。

2.2 各组小鼠脑梗体积比较 假手术组、缺血再灌注组、缺血再灌注+褪黑素组、缺血再灌注+褪黑素+SIRT1 抑制剂组脑梗死体积分别为0、44.1% ±6.4%、16.2%±5.2%、29.3%±5.7%。与假手术组相比，缺血再灌注组脑梗死体积增加（P＜0.05）；与缺血再灌注组相比，缺血再灌注+褪黑素组脑梗死体积减少（P＜0.05）；与缺血再灌注+褪黑素组相比，缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制剂组脑梗死体积增加（P＜0.05）。

2.3 各组小鼠脑组织自噬相关蛋白表达情况 与假手术组相比，缺血再灌注组脑组织LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg14表达降低（P均＜0.05）；与缺血再灌注组相比，缺血再灌注+褪黑素组LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg14表达增加（P均＜0.05）；与缺血再灌注+褪黑素组相比，缺血再灌注+褪黑素+SIRT1 抑制剂组LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg14 表达降低（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠脑组织自噬相关蛋白表达量比较（±s）

表1 各组小鼠脑组织自噬相关蛋白表达量比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与缺血再灌注组比较，bP＜0.05；与缺血再灌注+褪黑素组比较，cP＜0.05。

组别假手术组缺血再灌注组缺血再灌注+褪黑素组缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制剂组n 6 6 6 6 LC3Ⅱ/Ⅰ1.00±0.170.37±0.12a 0.77±0.14ab 0.47±0.13ac Beclin11.00±0.130.38±0.09a 0.83±0.12b 0.58±0.12abc Atg141.00±0.130.43±0.11a 0.90±0.13b 0.59±0.12ac

2.4 各组脑组织SIRT1-BMAL1 通路相关蛋白表达情况 与假手术组相比，缺血再灌注组SIRT1、BAML1表达降低，ac-BMAL1表达增加（P均＜0.05）；与缺血再灌注组相比，缺血再灌注+褪黑素组SIRT1和BAML1 表达增加，ac-BMAL1 表达降低（P均＜0.05）；与缺血再灌注+褪黑素组相比，缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制剂组SIRT1和BAML1表达降低，ac-BMAL1表达增加（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠脑组织SIRT1-BAML1通路相关蛋白表达量比较（±s）

表2 各组小鼠脑组织SIRT1-BAML1通路相关蛋白表达量比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与缺血再灌注组比较，bP＜0.05；与缺血再灌注+褪黑素组比较，cP＜0.05。

组别假手术组缺血再灌注组缺血再灌注+褪黑素组缺血再灌注+褪黑素+SIRT1抑制剂组n 6 6 6 6 SIRT11.00±0.110.35±0.13a 0.74± 0.17ab 0.41±0.14ac BAML11.00±0.160.43±0.13a 0.77±0.14b 0.51±0.12ac ac-BMAL11.00±0.181.86±0.25a 1.24±0.19b 1.61±0.22ac

3 讨论

研究表明，糖尿病是缺血性脑卒中的独立危险因素之一［10］，糖尿病患者较非糖尿病患者更易发生缺血性脑卒中。此外，糖尿病患者缺血性脑卒中的发病年龄也较非糖尿病患者显著提前，并且糖尿病患者发生脑卒中后，其脑卒中的复发率、致残率和病死率均显著增加。即使是血糖控制良好的糖尿病患者，其心脑血管事件的发生率也未能显著下降［11-12］。因此，如何减轻糖尿病CIRI具有重要的研究意义。

褪黑素是一种内源性的吲哚胺分子，由松果体和各种其他组织如大脑、皮肤、肠道、视网膜、晶状体和骨髓等合成。褪黑素的合成和分泌随着年龄的增长而显著减少，其相对缺乏可能与年龄相关的神经退行性疾病如缺血性脑卒中的病理生理有关［13］。褪黑素可通过激活多种细胞内信号通路，如SIRT1、SIRT3 等，对非糖尿病动物多脏器的缺血再灌注损伤具有保护作用。新近研究显示，褪黑素在自噬调控和线粒体保护中亦发挥了重要作用［14-15］。自噬作为一种机体自我保护的内源性机制，可被当成一种细胞能量代谢的调控方式。在细胞营养不足时，为了维持基本生存需要，可通过自噬溶酶体降解一些相对次要的蛋白及一些相对多余的细胞器来供给物质和能量，从而对细胞起到保护作用［16］。研究发现，高糖会破坏细胞自噬，从而引发神经组织产生病理改变。通过恢复自噬，排除机体内有害分子，可促进细胞内稳态恢复，减缓这一病理生理改变［17-18］。相关研究发现，自噬对糖尿病缺血再灌注损伤的保护作用显著减弱或消失，但其相关病理机制研究甚少。

新近研究表明，SIRT1-BMAL1 通路在昼夜节律、DNA 损伤修复、细胞存活等多项生命活动中发挥关键作用。SIRT1属于Sirtuins家族成员之一，Sirtuins 是一群保守的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶家族，可通过去乙酰化调节多种转录因子、酶和蛋白质，从而在转录、基因组稳定性、代谢和寿命调控等过程中发挥重要作用［19］。SIRT1作为研究最为广泛的Sirtuins家族成员，在大脑中的表达水平显著高于其他器官，其可通过调节多种下游基因进而调控自噬、应激、衰老等［20］。BMAL1 作为核心生物钟蛋白，是中央生物钟起搏器的重要组成部分，在脑中高度表达。除了调节昼夜节律外BMAL1 还可作为转录因子激活许多基因的表达，并且在调控多种重要病理生理事件（包括葡萄糖稳态、脂质代谢和血栓形成）中发挥重要作用［21］。同时BMAL1 也被证明是自噬的正性调节剂，而自噬又与多种疾病的病理生理过程高度相关。BMAL1 的转录活性受翻译后修饰（如泛素化、乙酰化等）的调控。有趣的是SIRT1 被证明在组蛋白去乙酰化和调控各种转录因子中发挥重要作用，其可去乙酰化并激活BMAL1。此外，有报道发现BMAL1的乙酰化可导致其自身降解［22］。

本研究结果显示，缺血再灌注组脑组织神经元数量减少，胞体皱缩，胞质疏松并伴有空泡形成，胞核溶解或消失，脑梗死体积增大，SIRT1-BMAL1 通路相关蛋白表达降低，ac-BMAL1 表达升高，LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1 和Atg14 表达降低，表明BMAL1 去乙酰化水平降低，自噬相关蛋白表达被抑制；而缺血再灌注+褪黑素组脑组织损伤减轻，脑梗死体积减少，SIRT1-BMAL1 通路相关蛋白表达升高，ac-BMAL1表达降低，Atg14、Beclin-1 和LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高，提示我们褪黑素可能是通过SIRT1-BMAL1 通路调控自噬进而发挥神经保护作用；而当联合使用SIRT1抑制剂EX527 阻断SIRT1-BMAL1 通路后，褪黑素的神经保护作用被削弱，证实褪黑素的保护作用是通过SIRT1-BMAL1通路发挥作用的。

综上所述，褪黑素可预防糖尿病CIRI 大鼠的脑损伤，保护脑神经；其机制可能是通过激活SIRT1-BMAL1通路介导的自噬来发挥作用。