天降血栓通丸抑制动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块形成的作用及其机制

2022-05-20赵聪娜韩鹏飞张宝楠王居平

山东医药 2022年14期

赵聪娜，韩鹏飞，张宝楠，王居平

1 天津市北辰区中医医院肾病科，天津 300400；2 天津市北辰区中医医院检验科；3 天津市北辰区中医医院心病科

动脉粥样硬化（AS）以动脉壁脂质沉积产生病理性斑块为病理特征，是冠心病、脑梗死等缺血性心脑血管疾病的主要病理基础。AS的发生机制复杂，涉及氧化应激、炎症反应等多种病理过程［1］。研究表明，Toll 样受体4（TLR4）介导的信号通路是AS 炎症反应的主要炎症信号通路［2-3］。髓样分化因子88（MyD88）和核转录因子κB（NF-κB）是TLR4 的关键下游分子，也是炎症反应中重要的炎症因子，TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路已被证实是炎症反应中最重要的炎症信号通路［4］。因此，以TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路为治疗靶点有可能在抑制AS 炎症反应中发挥关键作用。天降血栓通丸是以补阳还五汤为基本方加减化裁而成，具有活血化瘀、益气养血的功效［5］。动物实验表明，天降血栓通丸能够抑制ApoE-/-小鼠的脂质代谢紊乱，减轻炎症反应，从而抑制AS 的发生发展；在2 型糖尿病肾病动物模型中，天降血栓通丸被证实具有调节血脂、保护血管内皮功能和抑制炎症反应的作用［6］。但目前关于天降血栓通丸对AS 的作用机制研究尚少。2020 年7月—2021 年9 月，我们通过饲喂高脂饮食建立ApoE-/-小鼠AS 模型，观察天降血栓通丸对AS 小鼠主动脉斑块形成的抑制作用，并探讨其作用机制与TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路的关系，为临床治疗AS提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级C57BL/6 雄性小鼠12 只与ApoE-/-雄性小鼠62 只，8 周龄，体质量（20±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养于北京大学SPF 级实验动物房，饲养温度20～25 ℃，相对湿度50%～60%，昼夜时长1∶1，自由饮水采食。用普通饲料适应性饲喂1周后用于实验。

1.1.2 药物与试剂高脂饲料（含20%蔗糖、15%猪油、2%胆固醇、0.2%胆酸钠，购自北京华阜康生科技股份有限公司）；天降血栓通丸（天津市北辰区中医医院门诊），阿托伐他汀片（辉瑞制药有限公司）；脂多糖（LPS，TLR4 激动剂，北京康瑞纳生物科技有限公司）。总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、单核细胞趋化因子1（MCP-1）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）检测试剂盒（上海酶研生物科技有限公司），白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）检测试剂盒（南京建成生物研究所），油红O 染色液（武汉纯度生物科技有限公司），BCA 蛋白浓度测定试剂盒、RIPA蛋白裂解液（北京索莱宝公司），TLR4、MyD88、NF-κB、β-actin抗体（英国Abcam公司）。

1.1.3 实验仪器 BS-280全自动生化分析仪（南京贝登医疗股份有限公司）；Applied Biosystems PCR 仪（美国Thermo公司）；WD-9417B酶标检测仪（上海易汇生物科技有限公司）；CX21光学显微镜（日本奥林巴斯）；GelDoc Go凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。1.2 模型制备与实验分组 C57BL/6小鼠饲喂普通饲料作为正常对照组，ApoE-/-小鼠饲喂高脂饲料制备AS模型。喂养8周后，随机选取2只ApoE-/-小鼠观察主动脉病理变化，以出现AS斑块为建模成功。将剩余60只ApoE-/-小鼠采用随机数字表法分为模型组、阿托伐他汀组、天降血栓通丸低剂量组、天降血栓通丸高剂量组、天降血栓通丸+LPS组，每组12只。

1.3 药物制备与干预天降血栓通丸加工浓缩制成含生药2.25 g/mL 的药液；阿托伐他汀片用0.9%氯化钠溶液制成1.5 mg/mL混悬液。阿托伐他汀组灌胃400 μL 阿托伐他汀混悬液，天降血栓通丸低剂量组和高剂量组分别灌胃含生药4.5、9.0 g/mL 的天降血栓通丸药液400 μL。天降血栓通丸+LPS 组先后给予200 μL 天降血栓通丸药液（18.0 g/mL）和10 g/mL LPS 200 μL 灌胃。正常对照组与模型组给予生理盐水400 μL灌胃。每天1次，连续灌胃8周。1.4 主动脉斑块面积观测算采用油红O染色法。处死小鼠，分离主动脉，取一段加入4%多聚甲醛固定，脱水，透明，石蜡包埋，制作病理切片。加入油红O 染色液染色，50%乙醇分化，蒸馏水冲洗返蓝，甘油明胶封片。光学显微镜下观察组织形态学变化并拍照，采用Image J 软件测定斑块面积和血管面积，计算主动脉斑块面积占总血管面积的比值。剩余主动脉置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.5 血脂、血清炎症因子及细胞黏附分子水平检测给药结束后，小鼠禁食12 h，使用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，打开腹腔，腹主动脉取血，置于抗凝管中，4 ℃下3000 r/min离心10 min，收集血清。采用全自动生化分析仪检测TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平，ELISA 法检测IL-6、IL-1β、TNF-α 及MCP-1、ICAM-1、VCAM-1水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 主动脉组织中TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路相关基因表达检测采用RT-PCR 法。取冻存的主动脉，研磨成粉末，加入TRIzol 提取总RNA，逆转录合成cDNA。采用Primer Premier 6.0 和Beacon designer 7.8 软件进行荧光定量PCR 引物的设计。引物序列：TLR4 上游5＇-CCAGCCTCCTCAGAAACAGA-3＇，下游 5＇-TCCCTCCAGCAGTAAGAAG-3＇；MyD88上游5＇-TGGCATGCCTCCATCATAGTTAACC-3＇，下游5＇-GTCAGAAACAACCACCACCATGC-3＇；NFκB 上游5＇-ATAGAAGAGCAGCGTGGGGACT-3＇，下游5＇-GGATGACGTAAAGGGATAGGGC-3＇；β -actin上游5＇-GCCAACCGTGAAAAAGATG-3＇，下游5＇-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3＇。扩增条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火25 s，共45个循环。以β-actin 为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算TLR4、MyD88、NF-κB mRNA的相对表达量。

1.7 主动脉组织中TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路相关蛋白表达检测采用Western blotting 法。取冻存的小鼠主动脉，研磨成粉末，加入RIPA 蛋白裂解液，提取总蛋白。BCA 法测定蛋白浓度，得出样品总浓度后进行上样、电泳、转膜、封闭。加入TLR4、MyD88、NF-κB 一抗（稀释浓度均为1∶1000）4 ℃孵育过夜；清洗，加入二抗（稀释浓度1∶3000）孵育。按照ECL 化学发光试剂盒说明书进行显色，应用凝胶成像系统扫描图像测定条带灰度值，以β-actin 为内参蛋白，计算TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法采用SPSS24.0统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较进行单因素方差分析，进一步两两组间比较行SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组主动脉斑块面积比较正常对照组、模型组、阿托伐汀组、天降血栓通丸低剂量组、天降血栓通丸高剂量组、天降血栓通丸+LPS 组的斑块面积占主动脉总面积的比例为0、33.08% ± 3.03%、15.14 %±1.23%、22.73%±2.34%、16.39%±1.66%、20.33% ± 1.94%。与模型组比较，阿托伐汀组、天降血栓通丸低剂量和高剂量组主动脉斑块面积减少，且天降血栓通丸高剂量组少于低剂量组（P均＜0.05）；天降血栓通丸+LPS 组斑块面积较天降血栓通丸高剂量组增加（P均＜0.05）。

2.2 各组血脂水平比较与正常对照组比较，模型组TC、TG、LDL-C 水平升高（P均＜0.05）；与模型组比较，阿托伐他汀组以及天降血栓通丸低、高剂量组TC、TG、LDL-C 水平降低（P均＜0.05）；天降血栓通丸高剂量组TC、TG、LDL-C 水平低于天降血栓通丸低剂量组（P均＜0.05），但与阿托伐他汀组比较无统计学差异（P均＞0.05）；与天降血栓通丸高剂量组比较，天降血栓通丸+LPS 组TC、TG、LDL-C 水平升高（P均＜0.05）。各组血清HDL-C 水平比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较（mmol/L，±s）