蒙药扎冲十三味丸灌胃对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能损伤的改善作用及其机制

刘跃辉，黎雨衫，刘海萍，陶春，张昕红，塔娜，张东威

1 内蒙古民族大学附属医院神经内科，内蒙 古通辽 028000；2 内蒙古民族大学生命科学与食品学院；3 内蒙古民族大学医学院

急性脑梗死是缺血性脑血管病主要致残、致死的类型，脑动脉取栓能够在最短的时间内开通闭塞的动脉血管，降低脑组织损伤程度，是目前治疗急性脑梗死最有效的措施。但大量研究显示，缺血的脑组织再次恢复血流后，可导致脑缺血再灌注损伤，其中细胞凋亡是缺血再灌注损伤导致细胞死亡的主要方式之一［1］。PTEN 是一种抑癌基因，近年来，关于PTEN 在脑缺血再灌注损伤过程中产生的负面效应已成为研究热点。动物实验显示，大鼠发生脑缺血再灌注损伤后，PTEN 被激活发生核转位，PTEN mRNA 表达增加，导致细胞凋亡，加重缺血再灌注后脑组织的损伤程度［2］。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）、Akt 和糖原合酶激酶3β（GSK-3β）是PTEN 的3 个下游信号蛋白［3-4］，PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路在CIRI过程中发挥重要作用。PTEN 通过调控PI3K、Akt、GSK-3β蛋白，与脑缺血再灌注后脑组织损伤加重密切相关，当PTEN 抑制或缺失，可以降低脑缺血再灌注损伤后诱发脑细胞凋亡和促进缺血脑组织神经保护作用［5］。故寻找抑制PTEN 的传统药物具有重要意义。蒙药扎冲十三味丸（扎冲-13）是蒙医治疗脑梗死常用的方剂，由禹粮土、制草乌、制珍珠、沉香、诃子、煅磁石、石菖蒲、制珊瑚、木香、麝香、甘草、肉豆蔻、丁香共13 味蒙药组成。现代药理研究显示，扎冲-13 可以通过减少氧化应激损伤、降低炎症反应、抑制脑细胞凋亡、改善微循环障碍、抗凝血等途径，减轻局部脑缺血损伤［6］，但其治疗机理尚未完全阐明。2017 年3 月—2019 年4 月，我们通过观察扎冲-13 对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能损伤的改善作用，探讨其作用机制与PTEN及PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF 级健康雄性SD 大鼠40 只，体质量（200 ± 20）g，由辽宁长生生物技术有限公司提供。饲养于内蒙古民族大学实验动物室，温度（23±2）℃，相对湿度50%～60%。适应性饲养1 周用于实验。

1.1.2 药品与试剂 扎冲-13（内蒙古蒙药股份有限公司，国药准字Z15020409）；TRIpure、Super MMLV 反转录酶、RNase inhibitor 均购自北京BioTeke公司；全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、PTEN 抗体、Akt 抗体均购自沈阳万类生物科技有限公司；PI3K 抗体、p-GSK-3β 抗体购自Proteintech公司；苏木精购自北京索莱宝公司。

1.1.3 主要仪器 WD-9413B 型凝胶成像系统（北京六一），超速冷冻离心机（湖南湘仪），Elx808 型全自动酶标仪（美国BioTek），NANO2000 紫外分光光度计（美国Thermo）；Exicycler96 荧光定量PCR 仪（韩国BIONEER），BX53显微镜（日本OLUMPUS）。1.2 动物分组与模型制作方法 将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、扎冲-13 高剂量组、扎冲-13 低剂量组各10 只。采用线栓法制作大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。用10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，沿颈部正中右旁侧切开，逐层分离，暴露右侧颈总动脉，挂线备用。随后于颈外和颈内动脉挂线，分离露出颈外动脉主干，在其根部打结。用动脉夹夹闭颈内动脉和颈总动脉近心端。在颈总动脉近头端距分叉部5 mm 左右斜剪一小口，导入线栓进入颈内动脉。移除颈内动脉上的动脉夹，将线栓插至所需深度，遇阻力即停。结扎切口处颈总动脉挂线，移开颈总动脉上的血管夹。确认无出血后开始计时，缺血1 h后拔除线栓形成再灌注。假手术组不插入线栓，颈部手术及血管处理同模型组。

1.3 干预方法 根据人民卫生出版社的《药理实验方法学》，大鼠剂量=人剂量×70 kg×0.018/200 g，计算出高剂量组给药剂量为1.728 g/kg，低剂量组给药剂量为0.432 g/kg。在缺血再灌注的同时，扎冲-13 高剂量组和低剂量组分别给予扎冲-13 药液1.728、0.432 g/kg 灌胃，模型组与假手术组灌胃等量生理盐水，连续给药7 d。

1.4 大鼠神经功能缺失程度评估 大鼠缺血再灌注后72 h，采用longa 评分法对各组大鼠进行神经功能缺失评分。0 分：无任何神经功能缺损的症状，活动正常；1 分：轻微神经功能缺损，对侧前肢保持屈曲状态；2 分：中度神经功能缺损，向对侧爬行转圈；3 分：重度神经功能缺损，向偏瘫侧身体倾倒；4 分：无法自主行走，意识丧失；5 分，死亡。以1～4 分为造模成功。连续给药7 d后再次评分。

1.5 脑组织PTEN mRNA 表达检测 采用RT-PCR法。大鼠处死，取脑组织约20 mg，加入1.0 mL TRIzol提取总RNA，使用紫外分光光度计NANO2000测定各样本中RNA 的浓度。将上述RNA 样品逆转录，获得相应的cDNA，-20 ℃保存。以cDNA 为模板进行实时荧光定量PCR 反应。引物序列：PTEN 上游5＇-FAGACCATAACCCACCACAGC-3＇，下 游5＇-TACACCAGTCCGTCCTTTCC-3＇，产 物 长 度20 bp；βactin 上 游5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3＇，下游5＇-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3＇，产物长度25 bp。反应条件：95 ℃变性3 min，60 ℃退火/延伸30 s，循环40 次。采用2-ΔΔCt法计算PTEN mRNA的相对表达量，每个样品重复检测3次。

1.6 脑组织PTEN 蛋白检测 采用Western blotting法。取大鼠脑组织约20 mg，加入裂解液提取组织蛋白，用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。取30 μg 蛋白上样，连接电泳装置，电压设为120 V 恒压，1.5 h 后停止电泳。加入含5%脱脂奶粉的PBST 溶液室温封闭2 h，加入封闭液稀释的PTEN 抗体（稀释比例1∶500），4 ℃孵育过夜。加入封闭液稀释的二抗羊抗兔IgG-HRP（稀释比例1∶5000），室温孵育1 h。TBST 洗膜，ECL 化学发光液显影。使用凝胶图像处理系统分析目标条带的光密度值，以PTEN 蛋白与β-actin的比值表示PTEN蛋白的相对表达量。

1.7 脑组织PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达检测 采用免疫组化法。取各组大鼠半边脑组织，石蜡包埋，切片。常规切片脱蜡、乙醇梯度水化，PBS冲洗；加入3%甲醇双氧水20 min，PBS 冲洗3 次，滴加抗原修复液Ⅰ，室温反应10 min，PBS 冲洗；滴加山羊血清封闭液，室温反应20 min；甩去多余液体，滴加IL-6 一抗（稀释比例1∶80）、STAT3 一抗（稀释比例1∶80），4 ℃过夜。次日室温复温后，PBS 漂洗，加入二抗，37 ℃避光孵育20 min。PBS 漂洗，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。于光学显微镜下以400 倍镜头观察，棕色颗粒为阳性，采用MetaMorph 图像分析软件计算平均光密度值。

1.8 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，若方差齐用LSDt检验，方差不齐则用Dunne＇t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺失评分比较 见表1。造模后72 h及连续给药7 d后，假手术组神经功能缺失评分均为0。与假手术组比较，模型组、扎冲-13低剂量组和扎冲-13 高剂量组神经功能缺失评分升高（P均＜0.01）；与模型组比较，扎冲-13 低剂量组和高剂量组评分降低（P＜0.05 或＜0.01），且高剂量组低于低剂量组（P＜0.05）。

表1 各组大鼠术后不同时间点神经功能缺失评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠术后不同时间点神经功能缺失评分比较（分，±s）

注：与假手术组相同时点比较，*P＜0.01；与模型组相同时点比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与扎冲-13 低剂量组相同时点比较，▲P＜0.05；与同组术后72 h比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别假手术组模型组扎冲-13低剂量组扎冲-13高剂量组n 10101010神经功能缺失评分术后72 h 02.60±0.52*2.40±0.70*2.40±0.82*术后7 d 02.56±0.83*2.03±0.76*#△1.86±0.75*##▲△△

2.2 各组大鼠脑组织PTEN mRNA及蛋白表达量比较 见表2。与假手术组比较，模型组脑组织PTEN mRNA 及蛋白表达量升高（P均＜0.01）；与模型组比较，扎冲-13 低剂量组和高剂量组PTEN mRNA 及蛋白表达量均降低，且扎冲-13 高剂量组PTEN mRNA及蛋白表达量低于低剂量组（P均＜0.01）。

表2 各组大鼠脑组织PTEN mRNA及蛋白表达量比较（±s）

表2 各组大鼠脑组织PTEN mRNA及蛋白表达量比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与扎冲-13低剂量组比较，▲P＜0.01。

组别假手术组模型组扎冲-13低剂量组扎冲-13高剂量组n 10101010 PTEN mRNA 1.00±0.065.52±0.39*4.00±0.18#2.77±0.18#▲PTEN蛋白0.16±0.020.84±0.26*0.72±0.36#0.54±0.33#▲

2.3 各组大鼠脑组织PI3K、Akt、p-GSK-3β 蛋白表达量比较 见表3。与假手术组比较，模型组脑组织PI3K、Akt、p-GSK-3β 蛋白表达量降低（P＜0.05 或＜0.01）；与模型组比较，扎冲-13 低剂量组Akt 蛋白表达量升高，扎冲-13 高剂量组PI3K、Akt、p-GSK-3β蛋白表达量升高（P＜0.05 或＜0.01）；与扎冲-13 低剂量组比较，扎冲-13 高剂量组PI3K 表达量升高，Akt蛋白表达量降低（P＜0.05或＜0.01）。

表3 各组大鼠脑组织PI3K、Akt、p-GSK-3β蛋白表达量比较（±s）

表3 各组大鼠脑组织PI3K、Akt、p-GSK-3β蛋白表达量比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与扎冲-13低剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别假手术组模型组扎冲-13低剂量组扎冲-13高剂量组n 10101010 PI3K 0.0102±0.01320.0024±0.0001**0.0026±0.0008**0.0157±0.0180*##▲▲Akt 0.0309±0.02280.0049±0.0018*0.0700±0.0219##0.0287±0.0074##▲p-GSK-3β 0.0047±0.00030.0006±0.0005**0.0011±0.0005**0.0017±0.0001**#

3 讨论

急性脑梗死是我国成年人致死和致残的首位原因，严重威胁我国人口的健康并阻碍社会经济的发展。脑梗死发生后，脑血流量减少导致能量障碍，细胞内多种死亡、生存信号通路被激活，引起程序性细胞死亡。脑梗死的病理机制十分复杂，包括兴奋性毒性、离子失衡、线粒体功能障碍、氧化应激和炎症反应等。现代医学通过抗炎症反应、抑制血小板集聚、稳定斑块、溶栓及血管内介入等方法治疗AIS，虽然疗效尚可，但药物不良反应及血管内介入的风险较大，且价格昂贵。蒙医药治疗急性脑梗死的历史悠久且有较好的临床疗效。扎冲-13 是蒙医常用的传统方剂，长期临床实践显示，其在治疗缺血性脑血管疾病方面疗效显著，价格低廉，不良反应相对较小，已被广大北方蒙古族脑卒中患者接受。我们的前期研究显示，扎冲-13能够减轻脑梗死大鼠缺血部位脑细胞的水肿、缩小梗死面积，减轻大鼠神经功能损伤程度；通过降低缺血脑组织中Bax 蛋白表达，同时上调Bcl-2 蛋白表达，从而抑制脑细胞凋亡；通过降低缺血脑组织中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α蛋白表达水平，从而减轻炎症反应程度［7-8］。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组、扎冲-13低剂量组和扎冲-13高剂量组神经功能缺失评分升高，表明模型大鼠符合实验要求，证实线栓法制作MCAO 模型成功；与模型组比较，扎冲-13低剂量组和扎冲-13高剂量组大鼠神经功能缺失评分均显著降低，表明扎冲-13能够减轻大鼠神经功能损伤的程度。

PTEN 是迄今为止发现的第一个具有双重特异性磷酸酶活性的高度保守的抑癌基因，其编码蛋白可特异性使磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP3）去磷酸化，拮抗PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路，干扰细胞生长信号而诱导细胞死亡，表现为对细胞存活和增殖的负性调控作用［9］。PTEN 缺失可抑制缺血性脑损伤诱导的神经元死亡和促进脑缺血动物的神经保护作用［10］。NING 等［11］对脑缺血损伤大鼠采用短干扰RNA 技术下调PTEN 基因表达，发现其对损伤的神经元有明显的保护作用。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组PTEN mRNA 及蛋白表达量升高，表明脑缺血再灌注损伤上调PTEN 基因表达；与模型组比较，扎冲-13 高剂量组和低剂量组PTEN 蛋白表达量均降低，表明扎冲-13 可能通过调控PTEN mRNA，抑制PTEN 蛋白表达，对缺血再灌注损伤大鼠的脑细胞发挥神经保护作用。

PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路对调节细胞周期、细胞生长和增殖、主要蛋白质的合成及糖代谢均有重要作用［12］。LIANG 等［13］报道，激活PI3K/Akt 信号通路对缺血再灌注损伤的脑组织有神经保护作用；HAO 等［14］报道，PI3K/Akt信号通路对脑缺血细胞凋亡具有调控作用，该通路激活后可抑制脑缺血细胞凋亡。PI3K是细胞内重要的信号转导分子，PI3K被激活后，可促使Akt 活化。GSK-3β 为Akt 的下游蛋白，活化的Akt 通过直接或间接途径激活GSK-3β，调节机体中细胞的生长、分化及迁移等［15］。HU等［16］报道，在急性脑缺血引起神经元凋亡的过程中，GSK-3β 信号表达起着关键作用。多项研究显示，Akt 激活可引起GSK-3β 磷酸化，抑制GSK-3β 表达，从而起到抗神经细胞凋亡的作用［17-19］。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组PI3K、Akt、p-GSK-3β蛋白表达量降低，表明缺血再灌注损伤后引起PTEN 基因表达上调，从而抑制PI3K、Akt、p-GSK-3β的表达；与模型组比较，扎冲-13 低剂量组Akt 蛋白表达量升高，扎冲-13 高剂量组PI3K、Akt、p-GSK-3β蛋白表达量升高，提示扎冲-13可能通过激活缺血性脑组织中PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路，从而抑制神经元凋亡。然而，本研究结果显示，与扎冲-13 低剂量组比较，扎冲-13 高剂量组PI3K 表达量升高，而Akt 蛋白表达量却相对下降，分析考虑扎冲-13 组成成分较多，化学成分复杂，随着应用药物剂量增大，可能出现药物不良反应。下一步我们将对这方面的结果继续观察。

综上所述，对脑缺血再灌注损伤大鼠给予蒙药扎冲-13 进行干预，可降低其神经功能缺失程度，其机制可能与抑制PTEN、激活PI3K/Akt/GSK3β 信号通路有关。