胎儿生长受限孕妇血清microRNA-424、sFlt-1 mRNA相对表达量对叶酸、维生素B12水平的影响*

崔照领，马丽静，殷欣欣，杨永红，莫中福

（石家庄市妇幼保健院，1.妇产科，2.功能科，河北石家庄 050051）

胎儿生长受限是指胎儿出生体重低于同孕周胎儿平均体重的2 个标准差，或低于同孕妇周胎儿正常体重的第10 百分位数，或足月分娩胎儿出生体重＜2.5 kg，与死胎、新生儿死亡、新生儿窒息等有关，严重影响人口质量。因此明确胎儿生长受限发生机制，早期预测胎儿生长受限的发生至关重要[1-2]。叶酸（folic acid, FA）、维生素B12（Vitamin B12, VitB12）是组织细胞合成DNA 的重要辅酶，与胎儿的生长发育密切相关[3]。研究表明，缺乏FA、VitB12可增加发育迟缓和缺陷的发生风险[4-5]。微小RNA（microRNA, miRNA）是约21～24 核苷酸的非编码RNA，可调控基因的表达，目前认为人类基因组中约30%的编码基因受到miRNA 的调控[6]。近年来报道发现，miRNA 与胎儿生长、肌纤维发育有关[7]。microRNA-424（miR-424）在胎儿生长受限中报道鲜见，是否与胎儿生长受限有关有待探讨。可溶性血管内皮生长因子受体-1（soluble fms-like tyrosine kinase receptor-1, sFlt-1）被证实与子痫发生有关，而子痫可导致胎儿生长受限，故推测sFlt-1可能参与了胎儿生长受限的发生，但尚需直接论证的报道[8]。鉴于此，本研究选取116 例胎儿生长受限孕妇，探讨其血清miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 相对表达量对FA、VitB12水平的影响及其与胎儿生长受限的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2017年1月—2019年1月在石家庄市妇幼保健院住院分娩的116 例胎儿生长受限孕妇（FGR 组）和116 例分娩正常胎儿孕妇（对照组）的临床资料。研究对象年龄20～43 岁。两组孕妇入组时新生儿性别构成、年龄、体质量指数（BMI）、孕周、产史、妊娠次数等资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 两组孕妇临床资料的比较 （n=116）

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：FGR 组孕妇分娩胎儿符合胎儿生长受限诊断标准[9]；对照组孕妇分娩胎儿正常；入组前4 周正常饮食，无FA、VitB12干预史；单胎活产；无酗酒、吸烟史。排除标准：合并妊娠期糖尿病、高血压者；肝内胆汁淤积症者；有输血史者；合并白血病者；伴有恶性肿瘤者；心、肾等存在严重功能障碍者；有药物滥用史者；合并甲状腺功能异常者。

1.3 主要试剂、仪器

FA、VitB12电化学发光法试剂盒（瑞士罗氏公司）；PCR 试剂盒[生物工程（大连）有限公司]；引物合成（北京擎科公司）；全自动电化学发光仪（Cobas8000 型，瑞士罗氏公司）；全自动荧光定量PCR 仪（DA7600 型，广州中山大学达安基因股份有限公司）；紫外可见分光光度计（Uv-2550，日本岛津公司）。

1.4 方法

1.4.1 血标本采集与检测两组孕妇于28～32孕周采集清晨空腹肘部静脉血5 mL，采用电化学发光法与全自动电化学发光仪检测FA、VitB12；采用qRT-PCR 检测miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 相对表达量，1.0 mL Trizol 加入0.2 mL 氯仿，震荡混匀，4℃12 000 r/min 离心15 min，分离上清液，入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min，4℃12 000 r/min 离心10 min，可见试管底部出现沉淀。弃去上清液，缓慢沿离心管壁加入75%的乙醇l mL，颠倒洗涤离心管管壁，4℃12 000 r/min 离心5 min，弃去乙醇，室温干燥RNA 沉淀，加入100 μL无酶水，充分溶解RNA，紫外可见分光光度计测定RNA 浓度。取上述RNA 3.199 μg，加入PCR 缓冲液4 μL、寡聚核苷酸引物2 μL、逆转录酶1 μL、浓度均为2.5 mmoL 的脱氧核糖核苷三磷酸混合物4 μL、RNA 抑制剂0.5 μL，加入无RNA 酶水至20 μL进行逆转录反应，反应条件：25℃预变性5 min，50℃变性15 min，85℃退火5 min，4℃延伸10 min，共40 个循环。取逆转录产物4 μL，加入正反向引物各0.4 μL、SYBR Green（荧光插入染料）/荧光素qPCR 预混液10 μL、水5.2 μL 进行qRT-PCR。miR-424 正向引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTC CGAGGTATTCGCACTGG-3′，反向引物：5′-CGAAC GAGCAGCAATTCAATTCATG-3′；miR-424 内参U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；sFlt-1 正向引物：5′-GGCACAAAGACCCAAAAGAA-3′，反向引物：5′-TGCTGTCAGTCCTGGTGAAG-3′； sFlt-1 内 参GAPDH 正向引物：5′-CAAATTCAACGGCACAGTCA A-3′，反向引物：5′-TGGTGAAGACACCAGTAGACT C-3′。反应条件：50℃预变性2 min，95℃变性10 min；95℃退火30 s，60℃延伸30 s，共40 个循环。绘制熔解曲线，最终数据以2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

1.4.2 胎儿生长参数的测定新生儿断脐后即擦干胎脂、羊水，分别测量新生儿出生体重、身高、腹围、头围及BMI。

1.5 观察指标

①胎儿出生体重、身高、腹围、头围、BMI；②孕妇血清miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA、FA、VitB12；③血清各指标与胎儿生长参数的相关性；④血清各指标预测胎儿生长受限的敏感性、特异性；⑤血清miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 与FA、VitB12的相关性。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以例（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Pearson 法；绘制受试者工作特征（ROC）曲线。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组胎儿生长参数比较

两组胎儿出生体重、身高、腹围、头围、BMI比较，差异有统计学意义（P＜0.05），FGR 组低于对照组。见表2。

表2 两组胎儿生长参数比较 （n=116，±s）

表2 两组胎儿生长参数比较 （n=116，±s）

组别FGR组对照组t 值P 值出生体重/kg 2.42±0.35 3.18±0.32 17.260 0.000身高/cm 48.17±2.04 50.02±1.85 7.235 0.000腹围/cm 33.26±1.32 34.75±1.59 7.766 0.000头围/cm 31.79±1.05 33.18±1.27 9.085 0.000 BMI/（kg/m²）10.43±1.08 12.71±1.12 15.783 0.000

2.2 两组孕妇血清各指标比较

两组血清miR-424 mRNA 和sFlt-1 mRNA 相对表达量以及FA 和VitB12水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），FGR 组miR-424 mRNA 和sFlt-1 mRNA相对表达量高于对照组，FA 和VitB12水平低于对照组。见表3。

表3 两组孕妇血清各指标比较 （n=116，±s）

组别FGR组对照组t 值P 值miR-424 mRNA 0.27±0.11 0.14±0.08 10.294 0.000 sFlt-1 mRNA 6.97±2.19 4.58±1.22 10.268 0.000 FA/（μg/L）4.25±1.42 16.88±5.01 26.123 0.000 VitB12/（ng/L）38.87±12.92 416.24±183.65 22.077 0.000

2.3 血清各指标与胎儿生长参数的相关性

miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 与胎儿出生体重、身高、腹围、头围及BMI 呈负相关（P＜0.05）；FA、VitB12与胎儿出生体重、身高、腹围、头围及BMI 呈正相关（P＜0.05）。见表4。

表4 血清各指标与胎儿生长参数的相关性

2.4 血清各指标预测胎儿生长受限的效能

ROC 曲线结果显示，miR-424 mRNA 预测胎儿生长受限的ROC 曲线下面积（AUC） 为0.790（95%CI：0.732，0.841），截断值＞0.18 时，敏感性为74.14% （95% CI：0.476，0.790），特异性为71.55% （95% CI：0.378，0.800）；sFlt-1 mRNA 预测胎儿生长受限的AUC 为0.777 （95% CI: 0.718，0.829），截断值＞6.39 时，敏感性为56.03%（95% CI：0.448，0.664），特异性为91.38%（95% CI：0.207，0.985）；FA 预测胎儿生长受限的AUC 为0.826（95% CI：0.771，0.873），截断值≤11.24 μg/L 时，敏感性为85.34%（95% CI：0.576，0.892），特异性为66.38%（95% CI：0.500，0.716）；VitB12预测胎儿生长受限的AUC 为0.831（95% CI：0.777，0.877），截断值≤255.24 ng/L 时，敏感性为85.34%（95% CI：0.322，0.948），特异性为67.24%（95% CI：0.517，0.802）；各指标联合预测胎儿生长受限的AUC 为0.909（95% CI：0.864，0.942），截断值为213.30 时，敏感性为85.34%（95% CI：0.672，0.957），特异性为82.76%（95%CI：0.767，0.905）。见图1、2。

图1 血清各指标单一预测的ROC曲线

图2 血清各指标联合预测的ROC曲线

2.5 血清miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 与FA、VitB12的相关性

血清miR-424 mRNA 与FA 和VitB12呈负相关（r=-0.583 和-0.668，均P＜0.05）；血清sFlt-1 mRNA与FA 和VitB12呈负相关（r=-0.596 和-0.681，均P＜0.05）。见图3、4。

图3 血清miR-424 mRNA与FA、VitB12的相关性

图4 血清sFlt-1 mRNA与FA、VitB12的相关性

3 讨论

FA 是一种水溶性维生素，参与体内氨基酸及核酸合成，并与VitB12共同促进红细胞的生成[10]。VitB12是唯一含必需矿物质的维生素，参与蛋氨酸、胸腺嘧啶等的合成，是甲基转移酶的辅因子，并能保护FA 在细胞内的转移和贮存，同时具有促进蛋白质的生物合成功能，缺乏时会影响婴幼儿的生长发育[11]。目前关于FA、VitB12在胎儿生长受限领域的报道较多，已经明确胎儿生长受限孕妇及胎儿脐血中FA、VitB12表达较正常孕妇与胎儿降低[12]。在动物实验中，补充FA 可以改善胎儿畸形和生长受限[13-14]。临床研究中亦发现，补充FA 可预防抽烟孕妇胎儿生长受限[15]。FA、VitB12缺乏，胸腺嘧啶核苷酸减少，DNA 合成速度减慢，并能通过上调同型半胱氨酸途径，影响子宫胎盘血流，降低胎儿对氧、营养物质的摄取，从而导致胎儿生长受限。目前临床上缺乏早期评估胎儿生长受限的方法，妊娠24～32 周进行超声检查亦不易发现，临床应用具有一定滞后性。本研究采用ROC曲线分析发现，FA 预测胎儿生长受限的AUC 为0.826，VitB12预测胎儿生长受限的AUC 为0.831，具有较高的预测价值，说明当FA 截断值≤11.24 μg/L时，VitB12截断值≤255.24 ng/L 时，有足够的证据预测胎儿生长受限，从而为临床早期针对性干预提供重要的参考信息。

胎盘为胎儿生长发育提供营养，其发育需足够、协调的血管生长因子。血管内皮生长因子可介导血管重铸，参与以上过程，在胎盘和胎儿生长发育中扮演重要角色[16]。在妊娠中晚期，胎盘血管生成主要为分支结构向非分支结构变化，形成终末绒毛，即胎盘的功能单位，若血管生成异常，可导致妊娠期高血压、胎儿生长受限等异常妊娠[17]。sFlt-1 是血管内皮生长因子高亲和力受体，能竞争性结合血管内皮生长因子，是血管内皮生长因子的抑制因子[18]。本研究FGR 组sFlt-1 mRNA高于对照组，提示sFlt-1 与胎儿生长受限有关。妊娠期女性血清中sFlt-1 主要来源于胎盘组织，是一种主要的内源性抗血管生成因子，过表达的sFlt-1竞争性结合游离的血管内皮生长因子后，导致血管内皮生长因子水平的降低，使新生血管生成减少，滋养细胞合成减少，引起螺旋小动脉管腔狭窄，降低子宫胎盘血流量，影响母胎营养交换，从而参与胎儿生长受限的发生[19-20]。sFlt-1 mRNA与胎儿生长各参数呈负相关，负调控胎儿的生长发育。ROC 曲线分析结果显示，sFlt-1 mRNA 预测胎儿生长受限的AUC 为0.777，可为临床早期预测胎儿生长受限的发生提供参考，以便于及时干预和妊娠结局的改善。Pearson 相关性分析结果显示，sFlt-1 mRNA 与FA、VitB12呈负相关，说明sFlt-1 可影响FA、VitB12表达，这可能是其参与胎儿生长受限的另一机制。

miRNA 能通过与靶mRNA 3，非翻译区的碱基配对，介导靶基因的降解或翻译抑制，在基因调控、细胞增殖、分化及凋亡中起到重要作用，近年来文献报道了miRNA 在胚胎发育、胚胎干细胞发育、异常妊娠结局等方面的表达，通过参与炎症反应、子宫内膜植入等途径参与人类的妊娠[21-22]。在动物学研究中，miRNA 能通过调控血管生成、影响动物在子宫内发育与出生体重[23-24]。本研究显示，FGR 组miR-424 mRNA 相对表达量高于对照组，提示miR-424 与胎儿生长受限有关。胎盘血管形成异常是诱发胎儿生长受限的一个主要原因。在低氧环境下，胎盘内皮细胞进行增殖与分化，刺激血管形成，以增加胎儿供氧。miR-424 受血管异常形成的调控，具有抑制血管内皮细胞增殖的作用，可阻碍新生血管形成，造成功能缺氧，从而参与胎儿生长受限的发生[25]。Pearson 相关性分析结果显示，miR-424 mRNA 与胎儿生长各参数呈负相关，进一步证实miR-424 负调控胎儿的生长发育。miR-424 预测胎儿生长受限的AUC 为0.790，截断值为＞0.18 时，敏感性为74.14%，特异性为71.55%，可为临床预测胎儿生长受限的发生提供量化的数据参考，从而指导临床干预，改善妊娠结局。且miR-424 mRNA 与FA、VitB12呈负相关，表明miR-424 还通过FA、VitB12途径参与胎儿生长受限的发生。但受限于研究的前沿性，尚不清楚miR-424 影响FA、VitB12的详细机制，有待后续报道的进一步阐明。本研究不足之处在于，两组孕妇标本采集时间均在孕晚期，导致研究结果仅适用于孕晚期孕妇，而在其他孕周的孕妇中应用效果尚不清楚，有待后续的进一步探讨。

综上所述，胎儿生长受限孕妇血清miR-424 mRNA、sFlt-1 mRNA 呈高表达，并能通过影响FA、VitB12水平负调控胎儿生长发育，检测该指标有望成为预测胎儿生长受限的一个血清学方法。