不同甲基类诱食剂对罗氏沼虾的诱食效果

王晓倩，王天明，徐秀文

（1.浙江海洋大学国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii 又名马来西亚大虾、淡水长臂大虾和大头虾，隶属于甲壳纲Crustacea、十足目Decapoda，是世界上个体最大的淡水虾之一。罗氏沼虾是高蛋白、低脂肪的名贵水产品，其蛋白质含量约为20%，脂肪含量仅1.97%左右。它具有个体大，食性广，养殖周期短，出肉率高，肉嫩爽口等优点，经济价值较高，有很好的国内外市场前景。罗氏沼虾的蚤状幼体喜集群且需要生活在一定盐度的半咸水中，仔虾经过淡水驯化后可进入淡水养殖[1]。我国于1976 年从日本引进罗氏沼虾，次年突破其人工繁育[2]，进而扩大其养殖规模。同时，由于海水对虾类的养殖受病害影响大，其产量下降快，且短期内很难快速回升。因此，罗氏沼虾有望作为补充或顶替海水虾的候选虾。目前，在国际市场上，淡水虾这类潜在品种还没有得到很好的利用，在未来，罗氏沼虾的养殖将会是国家推动虾类养殖业发展及出口创汇的一个良好商机[3-4]。

植物蛋白源和其他非常规饲料原料在水产配合饲料中使用量的增加，造成配合饲料适口性较差和残留过多，导致食物资源浪费，养殖水体污染、水产动物死亡等问题的出现。而诱食剂（feeding attractant）因其能够提高动物食欲、摄食量并促进消化，有助于解决当前配合饲料的适口性和转化率问题，而在未来水产养殖业中具有广阔的发展前景[2]。不同诱食剂对同一种水产动物的诱食效果不同，目前水产动物中使用的较为广泛的诱食剂有：甜菜碱、DMPT 和氯化胆碱[2,5]。甜菜碱又名甘氨酸三甲胺内盐，同蛋氨酸一样，是一种高效活性甲基供应体，不仅对水产动物有诱食作用，还具有缓和应激反应、提高动物成活率的功效[6]。胆碱是一种维生素类物质，可调节脂肪代谢，防止脂肪在器官中的累积与病变，而氯化胆碱是胆碱的一类盐酸盐，是合成磷脂的原料，常用作水产动物饲料添加剂，用来提升动物的生产性能，降低饲料损耗[7]。DMPT即二甲基-β-丙酸噻啶，是一种广泛存在于海洋生物中的活性物质，不仅能促进甲壳类的摄食和脱壳行为，还能提高其运动和抗应激能力。DMPT 的作用范围广且显著，几乎对所有的水产动物都起作用[8]。

同一诱食剂的不同浓度对同一水产动物的诱食效果也不同[9-12]，饲料添加0.2%的甜菜碱能显著提高凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei 的摄食量[13]，饲料中添加0.21%氯化胆碱能降低异育银鲫Carassiusauratus gibelio 肝脏中脂肪的含量，提高其生长性能，增强其抗氧化和应激能力[14]，饲料中添加0.2%的DMPT能显著提高极火虾的摄食量[15]，所以有必要研究开发罗氏沼虾诱食剂的适宜浓度。本研究配制了不同浓度（0.2%、0.5%、1%和1.5%）的甜菜碱、氯化胆碱和DMPT，分别研究它们对罗氏沼虾的诱食效果，探讨3 种诱食剂对罗氏沼虾肠道内脂肪酶、肝胰腺内淀粉酶和胃组织中胃蛋白酶活性的影响，为筛选适宜的罗氏沼虾诱食剂种类和饲料添加剂量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象与养殖管理

实验使用的罗氏沼虾购自珠海辉腾水产养殖公司的淡水驯化苗种，虾苗平均体长0.8±0.20 cm，放养于放置遮蔽物的循环水养殖系统中，养殖水温控制在28 ℃左右，pH 控制在7.8～8.3，溶氧量保持在5 mg·L-1以上（使用海利牌V-30 超静强力泵，排气量30 L·min-1），氨氮小于0.15 mg·L-1，亚硝酸盐小于0.01 mg·L-1。养殖周期为3 个月，其间采用饱食投喂法，每天在上午9 点和下午5 点各投喂1 次，在每次投喂结束1 h后进行吸污（每次控制污水量在总水量的20%，并立即补充等量的养殖用水）。随机挑选健康活泼、附肢齐全、大小一致（平均体长3.52±0.20 cm，平均体重3.02±0.20 g）的罗氏沼虾在饥饿24 h 后分别进行诱食实验和酶活测定实验。

1.2 实验方法

诱食实验：实验装置由1 个带有出水龙头的观察缸（亚克力材质，60 cm×30 cm×10 cm）与2 个蠕动泵（各带有1 个泵管和1 个泵桶，LONGER BT100-2J）构成。2 个泵管（一端固定在观察缸上，一端放置于泵桶中，中间固定在蠕动泵上）分别充当左右进水口，1 个出水龙头充当出水口，具体装置见示意图1A。将观察缸中加入养殖用水13.86 L，在2 个蠕动泵的泵桶中分别添加紫色（泵管在左）和红色（泵管在右）的无毒有色染料，设定蠕动泵的水流量为76 mL·min-1，开启蠕动泵，观察2 根泵管中的染料在观察缸中的扩散路线，待2 种染料分别均匀充满观察缸（保证观察缸与地面平行）后开展实验（扩散路线见图1B 和C）。将3 种诱食剂，甜菜碱（98%，华菱化学）、氯化胆碱（98%，华菱化学）、DMPT（98.5%，华菱化学）分别用蒸馏水配制成不同的浓度（甜菜碱：0.2%、0.5%、1%和1.5%；氯化胆碱和DMPT：0.1%、0.5%、1%和1.5%），安装并调整好相机（索尼HDR-760EA）和三脚架（云腾668）的位置，清洗晾干原有泵桶与泵管中的溶液，将不同浓度的诱食剂分别加入泵桶中，启动蠕动泵。随机挑选1 只饥饿24 h 的罗氏沼虾放入观察缸中，录制15 min。每种浓度的诱食剂重复6 次，左右泵桶各放3 次（为消除实验对象对于方位的偏好性），每次实验后将全套实验装置清洗干净并用酒精彻底消毒（为消除诱食剂之间的干扰）。

酶活测定：准备10 个大小一致的玻璃缸（30 cm×20 cm×20 cm），随机选取9 个缸分别加入18 L 诱食实验中已配好的低、中、高浓度的诱食剂溶液（处理组：0.2%的甜菜碱、1%甜菜碱、1.5%甜菜碱、0.1%氯化胆碱、0.5%氯化胆碱和1.5%氯化胆碱、0.1% DMPT、1% DMPT、1.5% DMPT），其余1 个缸加入等量的养殖用水（对照组）。随机挑选饥饿了24 h 的罗氏沼虾，分别放在各个玻璃缸中，每个玻璃缸放6 只（n=6），等待4 h后，将虾取出，迅速解剖分离虾的胃、肠道和肝胰腺，将每6 只虾的相同组织合并为1 个样品，每个样品设3 个重复。准确称取冰水浴下机械匀浆，2 500 r·min-1，离心10 min，取上清分别测定胃中胃蛋白酶（pepsin，PP）、肠道中脂肪酶（lipase，LPS）和肝胰腺中淀粉酶（amylase，AMS）的活性，各消化酶酶活均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。

1.3 数据处理

通过ANY-maze 软件分析实验视频得到罗氏沼虾行为轨迹路线和热图等相关数据。采用SPSS 26.0软件和Excel 2019 软件对罗氏沼虾的行为参数和酶活数据进行分析和作图。数据分析时，应用单因素方差分析（ANOVA）和Duncan 多重比较，分析各组间平均值、标准差和显著性水平，其中，P＞0.05 时差异不显著；P＜0.05 时差异显著，P＜0.01 时差异极显著。结果用平均值±标准误（Mean±SE）表示。停留时间的定义如下：罗氏沼虾进入观察缸中实验区域（诱食剂区域和对照剂区域）的停留时间（单位·s-1）。

2 结果

2.1 1%浓度的诱食剂分别对罗氏沼虾运动轨迹的影响

罗氏沼虾代表性的运动轨迹图和热图中，诱食剂（1%）在左方区域，普通养殖用水在右方区域作对照剂，罗氏沼虾在诱食剂区域的轨迹路线均多于在对照剂区域的轨迹路线（图2）。

图2 罗氏沼虾在诱食剂（1%）区域及其对照剂（水）区域中代表性的运动轨迹图和热图（甜菜碱（A）、氯化胆碱（B）和DMPT（C））Fig.2 Representative motion track and heat map of M.rosenbergii in the attractant region and its control region（betaine（A）,choline chloride（B）and DMPT（C））

2.2 不同浓度的诱食剂分别对罗氏沼虾停留时间的影响

罗氏沼虾在各浓度的甜菜碱、氯化胆碱和DMPT 区域的停留时间均大于对照剂区域的停留时间（图3A、B 和C）。其中，罗氏沼虾在甜菜碱浓度为1%和1.5%时与对照剂相比有显著差异（P＜0.05）；罗氏沼虾在氯化胆碱浓度为0.5%和1%时，与对照剂差异显著（P＜0.05）；罗氏沼虾在DMPT 浓度为1%时，与对照剂差异显著（P＜0.05）。

图3 罗氏沼虾在不同浓度诱食剂区域及其对照剂（水）区域中的停留时间（甜菜碱（A）、氯化胆碱（B）和DMPT（C））Fig.3 Residence time of M.rosenbergii in different concentrations of attractant region and its control region（betaine（A）,choline chloride（B）and DMPT（C））

2.3 甜菜碱、DMPT 和氯化胆碱对罗氏沼虾脂肪酶活性的影响

在低、中、高3 种不同的诱食剂浓度中，罗氏沼虾肠道内脂肪酶的活性随着甜菜碱浓度的增加而增加，随着氯化胆碱浓度的增加表现为先增加后减少（图4A 和B）。罗氏沼虾脂肪酶活性在浓度分别为1%和1.5%的甜菜碱、0.1%的DMPT 和0.5%的氯化胆碱时与对照组的差异显著（P＜0.05），且当甜菜碱的浓度为1.5%时，差异极显著（P＜0.001），因中浓度（1%）和高浓度（1.5%）的DMPT 均对罗氏沼虾有致死效应，故无法判别（图4C）。

图4 不同浓度诱食剂对罗氏沼虾脂肪酶活性的影响（甜菜碱（A）、氯化胆碱（B）和DMPT（C））Fig.4 Effects of different concentrations of attractant on lipase activity of M.rosenbergii（betaine（A）,choline chloride（B）and DMPT（C））

2.4 甜菜碱、DMPT 和氯化胆碱对罗氏沼虾淀粉酶活性的影响

在低、中、高3 种不同的诱食剂浓度中，罗氏沼虾肝胰腺内淀粉酶的活性随着甜菜碱浓度的增加而增加，随着氯化胆碱浓度的增加表现为先增加后减少（图5A 和B）。罗氏沼虾肝胰腺内淀粉酶的活性在浓度分别为1%和1.5%的甜菜碱和0.5%的氯化胆碱时与对照组的差异显著（P＜0.05），因中浓度（1%）和高浓度（1.5%）的DMPT 均对罗氏沼虾有致死效应，故无法判别（图5C）。

图5 不同浓度诱食剂对罗氏沼虾淀粉酶活性的影响（甜菜碱（A）、氯化胆碱（B）和DMPT（C））Fig.5 Effects of different concentrations of attractant on amylase activity of M.rosenbergii（betaine（A）,choline chloride（B）and DMPT（C））

2.5 甜菜碱、DMPT 和氯化胆碱对罗氏沼虾胃蛋白酶活性的影响

在低、中、高3 种不同的诱食剂浓度中，罗氏沼虾胃组织中胃蛋白酶的活性随着甜菜碱浓度的增加而增加，随着氯化胆碱浓度的增加表现为先增加后减少（图6A 和B）。罗氏沼虾胃组织中胃蛋白酶的活性在浓度分别为1%和1.5%的甜菜碱、0.1%的DMPT 与0.1%、1%和1.5%的氯化胆碱时与对照组的差异显著（P＜0.05），因中浓度（1%）和高浓度（1.5%）的DMPT 均对罗氏沼虾有致死效应，故无法判别（图6C）。

图6 不同浓度诱食剂对罗氏沼虾胃蛋白酶活性的影响（甜菜碱（A）、氯化胆碱（B）和DMPT（C））Fig.6 Effects of different concentrations of attractant on pepsin activity of M.rosenbergii（betaine（A）,choline chloride（B）,and DMPT（C））

3 讨论

诱食作用在水产动物如凡纳滨对虾、异育银鲫、奥尼罗非鱼Oreochromis aureus×O.niloticus、鲫Carassius auratus 和鲤Cyprinus carpio 中均有发现[13,16-17]。本诱食实验发现，罗氏沼虾的运动轨迹与停留时间在诱食剂区域均多于在对照剂区域（图2 和图3），说明甜菜碱、氯化胆碱和DMPT 这3 种诱食剂对罗氏沼虾均有诱食作用，这些诱食剂溶于水产生的化学刺激均能引起罗氏沼虾的感知并使其发生相应的寻找、趋向行为。罗氏沼虾的停留时间随甜菜碱和DMPT 浓度的增加呈先上升后下降趋势，随氯化胆碱浓度的增加呈先上升后下降再上升趋势，其中，在1%和1.5%的甜菜碱、0.5%和1%的氯化胆碱以及1%的DMPT 区域的停留时间显著大于在对照剂区域的停留时间（图3），说明诱食剂的浓度对罗氏沼虾的诱食作用有影响，甜菜碱的浓度越高对罗氏沼虾的诱食作用越强，而氯化胆碱和DMPT 则非如此，因此，在开发罗氏沼虾专用诱食剂的浓度调配方面，甜菜碱比氯化胆碱和DMPT 更易把握。相关研究表明，水产动物在代谢过程中需要足够的甲基，而动物本身不能合成甲基，必须由外界摄入供给[18]。饲料中添加甜菜碱能对凡纳滨对虾、长吻鮠Leiocassis longirostris、黄鳝Monopterus albus、异育银鲫和斑点叉尾鮰Ietalurus punetaus 的生长性能和饲料转化率有帮助[17,19-22]，饲料中添加胆碱能显著提高凡纳滨对虾、中华绒螯蟹Eriocheir sinensis 幼蟹、异育银鲫的饲料转化率和增重率[14,23-24]，饲料中添加DMPT 能明显提高凡纳滨对虾的增重率[25]。本实验中甜菜碱、氯化胆碱和DMPT 这3 种诱食剂均对罗氏沼虾肠道内脂肪酶、肝胰腺内淀粉酶和胃组织中胃蛋白酶的活性具有正向影响（图4、5 和6），故甜菜碱、氯化胆碱和DMPT 这3 种诱食剂均可作为甲基供体，对水产动物甲基的摄入过程起到重要的补充作用。

在低、中、高3 种不同浓度中，罗氏沼虾脂肪酶、淀粉酶和胃蛋白酶的活性均随甜菜碱浓度的增加而增加，且在甜菜碱1%和1.5%的浓度时具有显著性（图4A、图5A 和图6A），表明甜菜碱对于罗氏沼虾的消化与吸收也起着一定的促进作用，且这种作用在小范围内随着甜菜碱浓度的增加而加强。在低、中、高3 种不同浓度中，罗氏沼虾肠道内脂肪酶、肝胰腺内淀粉酶和胃组织中胃蛋白酶的活性均随着氯化胆碱浓度的增加先增加后减少，且在0.5%的浓度时具有显著性（图4B、图5B 和图6B），表明氯化胆碱对于罗氏沼虾的消化与吸收也起着一定的促进作用，且这种作用在小范围内随着氯化胆碱浓度的增加而减弱。胆碱是维持鱼类正常生长的重要维生素，能够调节鱼类的神经发育、肝脏脂肪转运以及机体合成代谢等过程，研究显示，饲料中适量添加胆碱，能够促进多种鱼类生长，降低饲料系数，降低肝脏脂肪含量，增强免疫力、改善肉质等。由于胆碱稳定性较差，吸收率较低，目前在饲料中主要以氯化胆碱的形式添加[26]。胆碱和甜菜碱这2 种与代谢密切相关的物质可以相互转化：胆碱可以被氧化成为甜菜碱，从而提供代谢需要的甲基供体[21]。相关研究表明，甜菜碱不仅能刺激水产动物的嗅觉和味觉，提高对氨基酸的味觉反应，还有利于鱼虾类水产动物的新陈代谢，促进其摄食率、提高其增重率、降低其死亡率[2,27]。综合以上实验结果，甜菜碱比氯化胆碱更适宜作为罗氏沼虾的专用诱食剂。DMPT 能刺激水产动物的感觉系统，提高其摄食速度、采食量和消化酶的分泌，一定程度上也促进其生长和摄食抗逆性，同时改善其肉质品质，使淡水品种呈海产风味[28]。本研究发现，低浓度（0.1%）的DMPT 对罗氏沼虾脂肪酶和胃蛋白酶的活性有显著增强作用，中、高浓度的DMPT（1%和1.5%）对罗氏沼虾有致死作用（图4C、图5C 和图6C）。以往的实验通常研究添加不同剂量DMPT 的饲料对实验对象的诱食效果或蛋白酶活性的影响[16-17,25,29]，而本次实验是研究不同剂量的DMPT 水溶液对罗氏沼虾诱食效果或蛋白酶活性的影响，故其致死原因可能是DMPT 在水体中积累至一定浓度对罗氏沼虾的呼吸系统产生了不利影响，但具体原因还需进一步研究。