乳制品中金黄色葡萄球菌PCR快速检测方法的建立

2022-05-20张若鸿王晓芳李晓然尹树仁崔生辉郭云昌

核农学报 2022年6期

王纯张若鸿王晓芳李晓然尹树仁杨洋,* 崔生辉郭云昌

(1 河北科技师范学院食品科技学院，河北秦皇岛 066600；2 中国食品药品检定研究院，北京 100050；3 国家食品安全风险评估中心，北京 100022)

乳制品在人类饮食结构中占有重要地位，随着人们生活水平的不断提高，其消费量也逐渐增大[1]。乳制品营养丰富，为微生物提供了生长繁殖条件[2]。金黄色葡萄球菌广泛分布于自然环境中，是一种常见的食源性致病菌。当人体摄入金黄色葡萄球菌后，会引起呕吐、腹泻和败血症等多种疾病，严重威胁人类健康，对公共健康发展造成不利影响[3-4]。近年来，国内外发生的乳制品安全事件中，大部分是由金黄色葡萄球菌污染导致的食源性疾病暴发[5]。因此，迫切需要建立一种快速、灵敏准确的金黄色葡萄球菌检测方法。

传统细胞培养检测方法是食源性致病菌检测的“金标准”，具有成本低、准确度高等优点，但步骤繁杂、费力费时[6]。目前已经开发多种用于检测食源性致病菌的先进技术[7]，如生物传感器和基因芯片技术在病原菌检测方面具有高通量等优势，但这些技术实施需要专业的检测人员和设备[8-9]。常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)和免疫学检测方法通常存在检测灵敏度相对较低的问题[10]，一般需要对食品样品进行选择性增菌，待检细菌浓度达到104～105CFU·mL-1才能获得较为准确的结果[11]。乳制品中含有大量的PCR反应抑制因子，如脂肪、蛋白质和酶等，其基质的多样性和复杂性限制了PCR检测方法的灵敏度，对快速、灵敏检测方法的发展造成了巨大挑战[12]。目前，通常在检测前增菌12～16 h去除PCR反应抑制因子，虽然提高了检测灵敏度，但延长了检测时间，难以满足现场检测的实际需求[13]。因此，本研究将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆固定在滤纸片上吸附富集样品中的金黄色葡萄球菌，旨在建立一种高效、灵敏且无需增菌的PCR快速检测方法，为乳制品中金黄色葡萄球菌的快速检测提供技术支撑，进而更好地预防和控制金黄色葡萄球菌相关的食源性疾病暴发。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

试验菌株共180株，其中包含97株金黄色葡萄球菌、48株其他葡萄球菌和35株非葡萄球菌，菌株的详细信息见表1。上述所有菌株均来自美国模式微生物菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。使用无菌棉签分别从平板上取所有菌株的新鲜纯培养菌落，转移至含有脑心浸液和20%甘油的冷冻储存管中，混匀，然后在-80℃冰箱中冷冻保存备用。

各菌种的菌株培养：金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌菌株在胰酪大豆胨液体培养基(tryptic soy broth，TSB)中培养(37℃、24 h)；鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌在厌氧条件下的肉汤培养基中培养(42.5℃、20 h)；甲型和乙型溶血性链球菌在含有5%羊血的大豆酪蛋白琼脂培养基(tryptic soy agar，TSA)中培养(37℃、24 h)；蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在营养琼脂培养基上培养(31℃、48 h)；小肠结肠炎耶尔森氏菌在琼脂培养基上培养(27℃、48 h)；副溶血性弧菌在补充有3% NaCl的TSB中培养(37℃、18 h)；阪崎肠杆菌在无菌缓冲蛋白胨水培养基(buffered peptone water，BPW)中培养(37℃、20 h)；在微需氧条件(5%氧气)下，大肠弯曲菌和空肠弯曲菌接种在Bolton肉汤中培养(42℃、24 h)；李斯特氏菌菌株接种在脑心浸液培养基(brain heart infusion，BHI)中培养(37℃、18 h)。

1.2 主要试剂与仪器

TSA、TSB和BPW，美国BD公司；Bolton肉汤和营养琼脂培养基，美国Thermo Fisher Scientific公司；BHI，德国Merck公司；7.5%氯化钠肉汤、Baird-Parker培养基、革兰氏染色试剂盒、血平板、无水乙醇、石油醚、氨水、乙酸乙酯、二十烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)溶液和Tris-EDTA溶液(分子纯)，北京陆桥技术股份有限公司；纳米氢氧化钛(100～200 nm)和纳米氢氧化锆(50～100 nm)，北京德科岛金科技有限公司；牛血清白蛋白(5 mg·mL-1)、鲑鱼精DNA(0.05 mg·mL-1)、DNA Marker(100 bp)、Taq酶(5 U·μL-1)、 10×PCR buffer和dNTPs(1 mmol·L-1)，宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖，上海尚宝生物科技有限公司。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

X3R高速离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司；DF-101S磁力搅拌器，青岛聚创环保集团有限公司；C1000 Touch PCR仪，美国Bio-Rad公司；DYY-7C电泳仪，北京六一仪器厂；BioSpectrum 310凝胶成像系统，美国UVP公司。

1.3 试验方法

1.3.1 加标样品的制备本试验总共从本地(河北省秦皇岛市)市场收集了4种不同的乳制品，包括奶酪、生牛乳、全脂乳粉和脱脂乳粉。根据《GB 4789.10-2016 食品安全国家标准食品微生物检验金黄色葡萄球菌检验》[14]确认所有采集的乳制品均不含有金黄色葡萄球菌。样品人工污染过程在二级生物安全柜内进行。

生牛乳样品：将1 mL不同浓度(10倍系列稀释浓度：100～108CFU·mL-1)的金黄色葡萄球菌菌悬液人工污染到25 mL的生牛乳中，使样品中金黄色葡萄球菌的浓度依次为100、101、102、103、104CFU·25mL-1。

全脂和脱脂乳粉样品：将5 μL一滴不同浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液(共200 μL)分别接种在平铺的全脂乳粉和脱脂乳粉(各25 g)上。然后将接种的全脂和脱脂乳粉样品分别在生物安全柜中静置30 min，使菌液进一步吸附在样品中，再放入无菌均质袋内，4℃冰箱过夜吸附。隔天采用《GB 4789.10-2016 食品安全国家标准食品微生物检验金黄色葡萄球菌检验》[14]的方法对样品进行定量分析以确定目标菌浓度。在上述25 g全脂乳粉及25 g脱脂乳粉中分别加入25 mL无菌超纯水，磁力搅拌至完全溶解。奶酪样品：将5 μL一滴不同浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液(共200 μL)均匀地接种在25 g奶酪的正反面，将接种的奶酪放置在4℃的冰箱过夜吸附。隔天，采用《GB 4789.10-2016 食品安全国家标准食品微生物检验金黄色葡萄球菌检验》[14]的方法确定样品中目标菌的浓度。然后将90 mL 2%柠檬酸钠与25 g奶酪混匀制成均质液。最后使全脂乳粉、脱脂乳粉及奶酪均质液中金黄色葡萄球菌的浓度均为100、101、102、103、104CFU·25 mL-1。

1.3.2 加标样品的去脂肪处理将1 mL无水乙醇、1 mL氨水和1 mL石油醚分别加入到25 mL人工污染金黄色葡萄球菌的全脂乳粉、脱脂乳粉、奶酪和生牛乳的均质液中，混匀[15]。在12 000 r·min-1条件下离心5 min后，弃上清液。然后用1 mL 10 mmol·L-1的Tris-EDTA (TE，pH 值7.8)溶液充分溶解沉淀物。

1.3.3 纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆的固定首先将纳米氢氧化钛(100～200 nm)和纳米氢氧化锆(50～100 nm)按照5∶1、4∶1、3∶1、2∶1和1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 的比例溶解在含有10% SDS溶液和10 mmol·L-1TE的混合溶液中(pH值7.8)，磁力搅拌30 min(30℃)至完全溶解，然后过滤除菌，备用。之后使用打孔器制备直径为4.00 mm的滤纸圆片，放入广口瓶内高压灭菌15 min(121℃)，然后将其按照无菌操作放置在无菌的不同浓度比例的纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆溶液中，并磁力搅拌5 min至完全渗透。将处理过的滤纸圆片放入提前灭菌处理过的生物安全柜内，鼓风干燥，备用。最后，将固定了纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆的滤纸圆片在无菌超纯水中震荡清洗2次，除去固定不牢固的金属氢氧化物，将其放到生物安全柜内，再次鼓风干燥，备用。

1.3.4 滤纸片处理样品向1.3.2所得到的1 mL样品溶液中加入0.25倍体积的乙酸乙酯，均质2 min，然后于14 000 r·min-1离心10 min，去掉上清液。沉淀用100 μL无菌超纯水悬浮，再加到固定了纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆的滤纸圆片中。将吸附样品的滤纸圆片放入生物安全柜进行鼓风干燥，然后将其放入5 mL灭菌的10% SDS溶液中，涡旋震荡2 min，随后将滤纸圆片放入5 mL 10 mmol·L-1的TE(pH 值7.8)溶液中，涡旋震荡2 min并清洗2次。最后，将清洗后的滤纸圆片再次放到生物安全柜中进行鼓风干燥，备用。

1.3.5 金黄色葡萄球菌模板DNA的提取将吸附样品的纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆固定的滤纸圆片悬浮在0.5 mL混合溶液中，该混合溶液含有50 μL 0.05 mg·mL-1鲑鱼精DNA、50 μL 5 mg·mL-1牛血清白蛋白和400 μL无菌超纯水。采用快速沸腾裂解法提取金黄色葡萄球菌DNA[16];将含有上述0.5 mL混合溶液的离心管放入沸水中热裂解10 min。然后将细胞裂解物于冰上冷却至室温，12 000 r·min-1离心5 min，将上清液转移至干净的离心管内。在含有沉淀DNA的离心管中加入等量体积冷却的无水乙醇，12 000 r·min-1再次离心15 min，弃上清液，保留沉淀。最后，向沉淀DNA中加入100 μL无菌超纯水，溶解，将DNA样品分装，每份10 μL冷冻保存，用作PCR的模板DNA。

1.3.6 PCR体系建立本研究选取金黄色葡萄球菌的Nuc毒力基因作为目的基因，其特异性引物序列为5′-G C A G A T T T A C G A G A T A G A G G A A CA-3′和5′-T T T A G G T G G T T A T T T C C T G AC-3′，目的扩增产物大小为827 bp。

反应体系为50 μL：10×PCR缓冲液5 μL，dNTPs混合物4 μL，正、反向引物(40 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，模板DNA 1 μL，无菌超纯水38.75 μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，40个循环；最后72℃延伸10 min。将PCR扩增产物在4℃下保存，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，100 V电泳1 h，利用凝胶成像系统观察结果。

1.3.7 特异性试验分别提取来自ATCC的180株菌株的DNA作为模板，采用1.3.6的扩增体系，利用本研究检测方法的Nuc引物序列与公开发表的血浆凝固酶编码基因Coa引物序列特异性进行比较，验证该方法的特异性。Coa引物序列：Coa1：5′-C G C G G A T C C A G C T T A T T T A C A T G G G AT-3′；Coa2: 5′-C C G C T C G A G T T A T T T T G T T A C T C T A G GC-3′[17]。

1.3.8 灵敏度试验将金黄色葡萄球菌菌液用无菌超纯水10倍梯度稀释，再以不同的稀释浓度分别人工污染乳制品样品，获得所需的样品浓度为100～104CFU·25g-1或CFU·25mL-1。然后从人工污染的样品均质液中提取1 μL DNA模板进行PCR，比较各浓度条件下每种模板的扩增情况。在进行PCR之前，乳制品样品均利用国标法检测不含有金黄色葡萄球菌，并且每个样品均进行10次重复试验来确定该方法的最低检测限。

1.3.9 PCR方法在实际样品中的应用采集市售(河北省秦皇岛市)的4种乳制品样品(全脂乳粉、脱脂乳粉、奶酪、生牛乳)各500份。利用本研究建立的快速检测方法与《GB 4789.10-2016 食品安全国家标准食品微生物检验金黄色葡萄球菌检验》[14]对样品进行检测，比较2种方法的检测结果是否一致，从而验证本研究建立的检测方法的实用性。

1.3.10 试剂稳定性和实用性试验试验中使用的主要试剂包括金属氢氧化物纸片、各种缓冲液等，试剂的稳定性由试剂在不同保存条件下对该方法的灵敏度是否产生影响决定。首先将所用试剂在-20℃的温度下分别保存3、6、12个月，然后利用该方法对上述加标的4种乳制品样品进行检测，分别进行5次重复试验。

同样，试剂的保存条件同上，然后利用该检测方法对采集的市售4种乳制品样品(各500份)进行检测，并与《GB 4789.10-2016食品安全国家标准食品微生物检验金黄色葡萄球菌检验》[14]的检测结果进行比对，确定该方法所用的试剂耗材在长时间冷冻保存条件下的稳定性与实用性。

2 结果与分析

2.1 PCR方法的特异性

由表1可知，在Nuc引物序列的检测结果中，97株金黄色葡萄球菌呈阳性，而48株其他葡萄球菌及35株非葡萄球菌均为阴性。虽然Coa引物可以特异性检测所有非葡萄球菌，但在检测乳制品中的金黄色葡萄球菌及其他葡萄球菌时，出现了假阳性和假阴性结果。其中，共有11株金黄色葡萄球菌(如ATCC 27706、ATCC BAA-2527等)为阴性结果，产色葡萄球菌ATCC 43764和表皮葡萄球菌ATCC 35984均为阳性结果。可见，本试验Nuc引物序列对金黄色葡萄球菌的检测表现出了良好的特异性。

表1 PCR特异性测试结果Table 1 Specificity results of the PCR

表1(续)

2.2 PCR方法的灵敏度

根据试验条件优化，纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆在滤纸片上的固定比例为1∶1时吸附富集金黄色葡萄球菌的效果最好。灵敏度检测结果如图1和表2所示。由图1可知，当初始模板浓度为101CFU·25g-1或101CFU·25mL-1时，可见清晰条带，呈阳性结果，扩增产物大小为827 bp，与预期结果一致。由表2可知，当浓度低于101CFU·25g-1或101CFU·25mL-1时，该方法检测加标样品时均获得阴性结果；浓度高于101CFU·25mL-1或101CFU·25g-1时，均为阳性结果。此外，4种加标样品的10次重复检测结果一致，显示出良好的可重复性，说明全脂乳粉、脱脂乳粉和奶酪的检测限为101CFU·25g-1，生牛乳的检测限为101CFU·25mL-1。

注：M：100 bp DNA marker；1：阳性对照；2：阴性对照；3～5：101 CFU·25mL-1人工污染生牛乳样品中扩增的PCR产物；6～8：101 CFU·25g-1人工污染全脂乳粉样品中扩增的PCR产物；9～11：101 CFU·25g-1人工污染脱脂乳粉样品中扩增的PCR产物；12～ 15：101 CFU·25g-1 人工污染奶酪样品中扩增的PCR产物。Note: M: 100 bp DNA marker. 1: Positive control. 2: Negative control. 3-5: PCR products amplified from 101 CFU·25mL-1 of artificially contaminated raw milk samples. 6-8: PCR products amplified from 101 CFU·25g-1 of artificially contaminated whole milk powder samples. 9-11: PCR products amplified from 101 CFU·25g-1 of artificially contaminated skim milk powder samples. 12-15: PCR products amplified from 101 CFU·25g-1 of artificially contaminated cheese samples.图1 初始浓度为 101 CFU·25g-1或101 CFU·25mL-1的人工污染样品的 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products from artificially contaminated samples with an initial concentration of 101 CFU·25g-1 or 101 CFU·25mL-1

2.3 PCR方法的实用性

采用本研究PCR方法与国标法对实际乳制品样品的检测结果进行比较，结果如表3所示，该检测方法的检出率、符合率及活菌检测率与传统检测方法一致，验证了该PCR方法的可靠性。本研究采用的检测方法检测时间为4 h，而传统检测方法需要长达6 d，表明该检测方法的实用性较好。

2.4 试剂的稳定性与实用性

试剂稳定性检测结果见表4，试验所用试剂在 -20℃ 冷冻条件下保存3、6和12个月，5次重复检测结果一致，灵敏度均为101CFU·25g-1或101CFU·25mL-1。因此，本方法所用试剂耗材在-20℃条件下可至少保存12个月，其检测灵敏度不受影响，稳定性良好。

本试验采用的无需增菌的PCR与国标法在试剂不同保存条件下对实际乳制品样品的检测结果如表5所示。结果表明，试剂保存3、6和12个月，2种方法的检测率、符合率及活菌检测率均保持一致，表明所用试剂耗材在冷冻条件下可稳定保存至少12个月，该检测方法的实用性较好。

表2 PCR检测加标乳制品样品灵敏度结果Table 2 Sensitivity of PCR detection of spiked dairy samples

表3 PCR和常规方法在实际样品中检测金黄色葡萄球菌的比较结果Table 3 Comparison results of PCR and conventional methods for S. aureus detection in natural samples

表4 PCR试剂在-20℃保存下的稳定性检测结果Table 4 Stability results of PCR reagents stored at -20℃

3 讨论

近年来，金黄色葡萄球菌已成为继沙门氏菌和副溶血性弧菌之后的第三大食源性致病菌，而且金黄色葡萄球菌也是乳制品中普遍存在的食源性致病菌[18]。乳制品中金黄色葡萄球菌的快速检测是保障乳制品安全的重要措施之一。因此，基于纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆固定滤纸片的样品处理方法，建立无需增菌的PCR快速检测方法对乳制品的食品安全保障具有重要意义。

表5 PCR试剂在-20℃保存下的实用性检测结果Table 5 Application of the PCR reagents stored at -20℃

综合前人对乳制品中金黄色葡萄球菌检测方法的研究，分子检测方法针对SEs、Coa和Nuc等毒力基因的检测较多[19]。由于微生物基因的多样性，某些靶基因的保守性和特异性均具有一定缺陷，对PCR检测结果的准确性会造成影响，如编码肠毒素的基因[20]。不同地区、不同样本的金黄色葡萄球菌所携带的编码基因也不同[21]。因此，如果将产肠毒素编码基因用作靶基因，往往会导致靶细菌漏检。与Coa相比，本研究基于Nuc引物序列的检测并未出现假阳性和假阴性结果，具有较高的特异性。此外，菌株的数量，包括目标菌株和非目标菌株，对于特异性结果的准确度也很重要。然而，许多研究只测试了有限的菌株数量[22]，本研究共测试了180株菌株，菌株数量较为庞大，检测结果更具有准确性和说服力。

乳制品成分复杂，含有多种PCR反应抑制因子，容易导致检测方法的灵敏度降低。据报道，Lee等[23]和 Thapa等[24]分别在增菌12 h和6 h后检测食品中的金黄色葡萄球菌，获得的检测限分别为100CFU·mL-1和101CFU·mL-1。这与本研究灵敏度检测结果相似，但本研究无需增菌处理即可在4 h内获得低至101CFU·25g-1或101CFU·25mL-1的检测限。此外，目前已报道多种方法来消除PCR反应抑制因子，如较为常用的免疫磁分离(immunomagnetic separation，IMS)等[25-27]。尽管商业化的IMS平台可以自动分离和浓缩具有目标细菌的免疫磁珠，但仍具有局限性，如增菌时间较长，需要增菌3～8 h才能获得较低的检测限，检测时间较长等[28]。另外，免疫磁珠的捕获能力受到特异性免疫反应抑制剂的影响。碳水化合物、蛋白质和脂肪等食品成分通常会抑制抗体与靶分子的特异性结合[29]。相比之下，本研究基于金属氢氧化物表面的羟基基团可与微生物细胞表面配体结合的特性[30]，将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆固定在滤纸片上对金黄色葡萄球菌进行吸附富集，可以有效去除食品基质中的PCR反应抑制因子，无需在乳制品中进行前增菌，仅需使用常规PCR仪即可快速灵敏地检测大量的乳制品样品。

本研究采用无需前增菌的PCR快速检测方法在实际全脂乳粉、脱脂乳粉、奶酪和生牛乳样品中金黄色葡萄球菌的检测率分别为7%、5%、0%和13%。此外，国内外有研究表明乳制品中金黄色葡萄球菌的污染率较高[31-32]，近年来由食用乳制品导致的疾病暴发频率逐年升高，对人类公共健康造成了严重威胁，应引起相关部门和消费者的重视。本研究PCR快速检测方法可用于快速检测乳制品中的金黄色葡萄球菌，能够有效保障我国乳制品产业的安全发展及消费者健康。但本研究也存在一定的不足，如该方法无法区分活细胞、死细胞及受损细胞的DNA，也难以消除死菌残留的DNA造成的假阳性结果。因此，未来可开发一种能够有效区分样品中活菌与死菌的快速检测方法，从而进一步降低食源性疾病暴发的风险。此外，本研究仅将试剂储存了12个月以验证试剂的实用性，无法确定其具体的稳定性范围。未来将这种方法用于试验时，需要关注试剂的保存温度和保存时间。