6种家畜乳脂肪SFC-Q-TOF-MS指纹特征及建模可行性

许昀晖，郭军，刘宇婷，刘莉敏，郭保民

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018；2.内蒙古自治区农牧业科学院农牧业经济与信息研究所，呼和浩特010031）

0 引言

特种家畜乳[1-6]价格远远高于牛乳，极易被掺假和冒充[7]。食品完整性（Food Integrity）和食品真实性（Food Authenticity）正在逐步成为国际食品贸易新的市场准入准则和新的技术壁垒[8]，特种家畜乳指纹特征和真实性鉴别研究开发具有现实意义。超临界流体色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪（SFC-Q-TOFMS）是利用超临界流体CO2作为流动相的新型色谱-质谱联用技术，具有分离效率高、省时和环保等优势[9-12]，是鉴定化合物分子结构的理想工具，但直接利用其质谱图指纹数据建模未见报道。乳脂肪95%以上为TAGs，易被非极性溶剂正己烷提取[9,13]，本研究旨在探索乳脂肪正己烷提取物SFC-Q-TOF-M S质谱指纹数据，评价不经过TAGs分子鉴定而直接建立家畜乳真实性快速质谱判别模型的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

系统采集代表性乳样56份，每份采集自一个牧场。荷斯坦牛乳6份（有机牧场3份，非有机舍饲牧场3份），山羊乳5份，牦牛乳5份，水牛乳5份，原马乳10份，酸马乳10份，双峰驼乳15份。样品在采集现场液氮冷却，置于-20℃以下冷冻运输和保藏，样品室温解冻并均质处理后取样检测。

1.2 试剂

正己烷、甲酸（色谱纯），美国Fisher公司；甲醇、乙腈（质谱纯），美国Fisher公司；高纯二氧化碳（纯度≥99.999%），北京如源如泉科技有限公司。

1.3 仪器

超临界流体色谱-四极杆-飞行时间质谱仪（SFCQ-TOF-MS，型号XevoRG2-S Q-TOF-MS，电离源Z-spray，采集模式ESI+），沃特世；T18均质机，IKA；P型移液器（1000,100,10μL），法国Gilson公司。

1.4 方法

1.4.1 乳脂肪的萃取

准确量取100μL乳样于10 mL塑料离心管中，加入2 mL正己烷在室温下涡旋震荡2 min，然后放入离心机中以8 000 r/min转速离心15 min，静置分层，吸取约1 mL上清液，过0.22μm尼龙滤膜至进样瓶中进行质谱测定。

1.4.2 质谱采集

色谱柱型号Acquity UPC2BEH-2EP(100 mm×3.0 mm×1.7μm)；流动相：A相为超临界CO2，B相为甲醇-乙腈-甲酸溶液体积比250∶250∶1；流速1.0 m L/min；柱温50℃；样品室温度10℃；样品进样量1μL；背压1.1×104k Pa；流动相梯度洗脱程序0~2 min保持0.1%B，之后4 min内由0.1%B线性升至1%B，再在3 min内线性升至2%B，保持6 min，接下来的5 min内由2%B线性升至7%B，再在4 min内线性升至20%B，在0.5 min内返回初始流动相比例0.1%B，并保持1 min；整个数据采集过程持续25 min。

电喷雾电离源正离子模式（ESI+），在全信息串联质谱（MSE）模式下采集质量范围为m/z 50~1 200范围内的物质（数据处理截取480~910 m/z质量范围）；用质量浓度为400 ng/mL亮氨酸脑啡肽（LE）（m/z=556.2771 in ESI+）作为Lock mass，流速为10μL/min，扫描间隔为30 s；毛细管电压为3.0 k V；锥孔电压为25 V；锥孔气流量20 L/h；离子源温度120℃；脱溶剂气为氮气，流量800 L/h；碰撞气为氩气；低碰撞能量4 eV，高碰撞能量20~60 eV；原始数据采集软件为Waters UNIFI。

1.5 质谱分析

原始数据经Waters Masslynx 4.1软件降噪、基线校正和特征峰提取和对齐等前处理，获得总基峰色谱图（BPI），肉眼观察比较整体形态和各峰形态数量、保留时间等特征。每个样品BPI图截取保留时间5~14 min段所包含的质谱，用Waters Markerlynx XS进行预处理，质量窗口为20 mu；保留时间窗口为0.5 min；强度阈值为10 000 N/m2；5%峰高的峰宽为1.00 s；除燥程度为6.00，获得本研究后续研究用的总质谱图。

这样截取的总质谱图包含3 000~4 000多个质谱峰，用Markerlynx XS以乳脂肪甘油三酯（TAGs）总体分子离子质谱范围横向截留480~910 m/z，纵向截留相对丰度10%，20%，30%，50%范围的质谱范围，导入化学计量学软件Pirouette 4.5（美国Infometrix公司）进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），观察乳样以各分类变量聚类特征。PCA分析数据预处理方法有Mean-center（均值中心化）和Autoscale（标准化）。结果报道最优质谱截取的结果，即纵向截留30%质谱峰进行的PCA分析结果。

2 结果与分析

2.1 总基峰色谱图

6种家畜乳正己烷提取物的总基峰色谱图（BPI）保留时间为0~25 min，每个物种代表性BPI如图1所示。由图1可以看出，不同物种之间的色谱图有明显的形态差异。牛乳、牦牛乳和水牛乳3种色谱峰整体形状近似，均呈双峰状分布且有相似的峰群，出峰时间均集中在6~12 min；其他3物种乳基峰色谱图整体呈单峰状，出峰位置和各小峰复杂程度均有明显的物种差异；山羊乳的色谱峰数量最多且密集，出峰时间集中在5~12 min。原马乳和酸马乳的色谱峰形状相似且出峰时间最长，集中在5~14.5 min。双峰驼乳的色谱峰数量最少且出峰时间较短，主要集中在8~12.5 min。由图可以看出不同家畜乳的BPI图的形态、数量和出峰时间具有显著的差异，这提示色谱指纹用于物种真实性判别有很大潜力。但是每个物种各乳样总基峰色谱图形状十分接近，肉眼不好判别。BPI图截取保留时间4~15 min段，做进一步分析。

图1 6种家畜乳正己烷提取物总基峰色谱（BPI）

2.2 总质谱图

6种家畜乳的正己烷提取物在MSE模式下获得的分子离子峰[M+NH4]+保留时间4~15 min段BPI图对应的总质谱图，根据乳TAGs分子离子质荷比范围，横轴截取（m/z）480~910段，纵轴截取相对丰度大于30%的质谱图，结果如图2所示。每个物种每个样品质谱峰数量成千上万，无法肉眼分辨。将所有样品质谱图，即“质谱指纹”导出为数据矩阵，再借助化学计量学软件进行进一步的分析处理与判别。

图2 6种家禽乳正乙烷提取物截取的总质谱

2.3 质谱指纹特征

2.3.1 6种家畜乳总质谱指纹PCA分析

6种家畜乳总质谱指纹PCA分析结果如图3所示。由图3可以看出，不同家畜乳样品在3D空间内分别聚类，且聚类簇的距离远近符合物种分类学关系。牛、牦牛、水牛和山羊同属牛科，4者在三维空间聚集一处，共同分布于主成分2上方，但相互之间存在明显的分离趋势和单独聚类特征，山羊乳位于主因子2的右侧单独聚类，牛乳、牦牛乳和水牛乳位于主因子2的左侧，聚类簇样品点集中，在物种分类学上[15]，牛和牦牛同属牛科牛属，山羊属于牛科山羊属，牛乳、牦牛乳和水牛乳距离较山羊乳远，符合其物种分类学特征。原马乳和酸马乳在3D空间内聚集一处，少部分有胶着，但二者之间存在明显的分离趋势。双峰驼乳在三维空间内单独聚类，与其他物种家畜乳距离较远。总之不同物种乳脂肪质谱指纹极为不同，利用家畜乳正己烷提取物质谱指纹特征建立物种真实性判别模型可行。

图3 6种家畜乳总质谱指纹PCA得分向量

2.3.2 牛科家畜乳总质谱指纹PCA分析

对牛科的4种家畜乳（牛、牦牛、水牛和山羊乳）单独进行PCA分析结果如图4所示。PCA得分向量图显示4种家畜乳在三维空间分别聚类且分离趋势明显，水牛乳位于分割线右上方，牛、牦牛和山羊乳位于分割线左下方且分别单独聚类，聚类簇样品点集中，在物种分类学上[15]，牛和牦牛同属牛科牛属，山羊属于牛科山羊属，水牛属于牛科水牛属，四者进行PCA分析时，分别投射到三维空间内聚类也有明显的体现，牛乳和牦牛乳距离较水牛乳和山羊乳距离远，符合其物种分类学特征。同时还发现有机和非有机牛乳单独聚类且有明显的分离趋势。与张鑫[14]研究发现有机和非有机牛乳脂肪酸（Fatty Acid，FAs）指纹特征存在差异，二者PCA分析有明显分离趋势的实验结果相一致。应进一步开展相关研究并建立不同饲养模式下的家畜乳真实性判别模型。

图4 牛科总质谱指纹PCA得分向量

2.3.3 原马乳和酸马乳总质谱指纹PCA分析

对原马乳和酸马乳的正己烷提取物总质谱指纹进行PCA分析，由图5可以看出，二者分布于三维空间内的不同相区，酸马乳分布于主成分1下方且聚类簇样品点集中，原马乳呈条状单独聚类于三维空间内一处，二者之间有明显的分离趋势。说明原马乳和酸马乳之间的质谱指纹存在明显特征差异，提示质谱指纹可用于家畜乳不同加工模式下的乳真实性鉴别。

图5 原马乳和酸马乳总质谱指纹PCA得分向量

3 讨论

本研究首次对6种家畜乳脂肪的正己烷提取物SFC-Q-TOF-MS质谱指纹进行了直接比较和PCA聚类特征研究。乳脂肪95%以上为甘油三酯（TAGs），容易被正己烷提取[13]，因此本研究探讨的主要是乳脂肪TAGs的质谱。但鉴定TAGs分子结构是具有相当复杂性和挑战性，且非常耗时的一项工作[9,16]。在实践中判别特种家畜乳真实性应该力求简洁快速。本研究旨在研究乳脂肪的质谱指纹特征，从而寻求直接利用乳脂肪质谱数据建立家畜乳真实性的判别模型。利用质谱指纹建立乳的真实性判别模型可达快捷的目的。

结果表明正己烷提取乳脂肪的总基峰色谱图（BPI）直观地判别和区分不同家畜乳之间的差别，说明利用BPI图进行肉眼鉴别具有一定的可行性，适于少量样品的初步判别，但这不适合大量样品的比对和判别，显然利用现代软件分析技术会更稳健可靠。

MS图比BPI图复杂得多，无法用肉眼直接对比判别，但显然其中隐藏的信息和规律也很多，因此对其探索分析研究的空间也很大。根据刘宇婷[16]等鉴定具体甘油三酯的相对分子质量，对总体分子离子质谱范围横向截留480~910 m/z，去除杂质分子及碎片后借助化学计量学进行数据结构和聚类分析。本研究用PCA分析模块，直观地发现了乳脂肪正己烷提取物的质谱指纹具有显著的物种分类学特征，完全可用于乳品物种真实性和其他方面真实性的判别模型的建立和应用本研究发现的乳脂肪质谱指纹的物种差异，可为乳品真实性判别研究提供新的思路。乳的质谱指纹特征受多种因素共同作用和影响，除了物种之间的差异，其他因素如饲养模式、加工方式以及产地自然气候和地理条件也会对乳脂肪造成影响，因此今后应加大样本量、丰富乳脂肪质谱数据库，以期建立十分稳健的家畜乳真实性质谱指纹判别模型。另外今后也可探讨利用乳脂肪的质谱指纹鉴别饲养模式、加工方法和产地来源模型的可行性。

4 结论

家畜乳脂肪正己烷提取物的总基峰色谱图（BPI）的形态、数量和出峰时间均有明显的差异；利用乳脂肪质谱指纹建立家畜乳真实性判别模型可行，至少可建立物种真实性判别模型。也有望建立不同饲养模式，如有机和非有机饲养的判别。本研究对家畜乳进行全面的ESI+质谱扫描和分析，从独特的角度分析了家畜乳的差异，为乳品真实性鉴定提供创新思路和理论依据，同时也为继续研究提供了大量思路和手段参考。