多模态MRI参数联合血清miR-301a水平评估前列腺癌危险程度及预测早期复发的价值

罗瑛译, 韦利娥, 玉开温

前列腺癌是欧美老年男性生殖系统肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤，近年来，随着我国人口老龄化程度的加剧，前列腺癌在我国的发病率也呈逐年升高趋势，严重危害患者的生命健康和生活质量[1,2]。前列腺癌的危险程度与治疗方案密切相关，而术后复发是影响患者生活质量和生存期的重要原因[3,4]。因此，早期评估前列腺癌危险程度和预测患者术后复发情况对选择合适的治疗方案及改善患者预后具有重要意义。目前的研究认为，Gleason评分、血清前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)水平和TNM分期是前列腺癌危险程度和术后预后的重要决定因素，但Gleason评分和TNM分期均需通过穿刺活检或根治性前列腺切除术后病理学检查获得，具有一定的创伤性和滞后性[5]，而PSA的检测结果易受药物、炎症等的影响，在预测患者复发中也具有一定局限性。相关研究证实，联合常规MRI、扩散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)、动态增强磁共振成像(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging,DCE-MRI)的多模态MRI，在前列腺癌的早期诊断中具有一定应用价值[6,7]，而其在前列腺癌患者危险度评估和预后预测中的作用还较少被报道。miRNA是一种短链RNA分子，作为进化保守的基因调控因子，可能抑制或激活特定基因的表达。miRNA参与许多细胞过程，如增殖分化、迁移、侵袭和凋亡。一些研究已将miRNAs定位为癌症检测、预后和治疗的潜在生物标志物[8,9]。最近研究显示，miR-301a在前列腺癌患者血清中的表达水平升高，并且与不良预后有关[10,11]。本研究旨在探讨联合应用影像学(多模态MRI)参数和血清学指标(miR-301a水平)在评估前列腺癌危险度和预测预后中的作用，为早期选择治疗方案和改善患者预后提供新思路。

材料与方法

1.病例资料

选择2016年5月至2020年1月于广西医科大学第二附属医院及广西中医药大学第一附属医院进行前列腺癌根治术的50例前列腺癌患者作为研究对象，平均年龄(67.32±6.14)岁。病例纳入标准：①术后经组织病理学确诊为前列腺癌；②术前1个月内进行了多模态MRI(常规MRI、DWI、DCE-MRI)检查，且图像清晰；③术前均未接受内分泌治疗、放疗、化疗、生物免疫治疗及其他相关抗肿瘤治疗；④临床病理和影像学资料完整；⑤患者依从性强，全程参与随访。病例排除标准：①患有严重的心脑血管、肝、肾疾病；②合并其他部位肿瘤；③合并自身免疫性疾病或全身感染性疾病；④患有精神类疾病。此外，选择同期50例经病理学检查证实为良性前列腺增生的患者作为对照组，平均年龄(66.92±6.33)岁，且在MRI检查前均未接受治疗。

两组研究对象的年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。此项研究得到了医院伦理委员会的批准，所有患者均自愿参与研究，并签署了知情同意书。

2.研究方法

MRI检查及图像分析:采用Siemens Viro 3.0T MR成像仪、GE 750 3.0T MRI 成像设备行MRI检查，腹部相控线圈，叮嘱患者尽可能保持平静呼吸，扫描序列包括T1WI、T2WI、抑脂T2WI、DWI、DCE-MRI。DWI(采用单次激发EPI序列)扫描参数：b值取800 s/mm2，层间距0 mm，层厚3 mm，TR 2000 ms，TE 56.3 ms，矩阵128×128，视野36.0 cm×32.4 cm，扫描时间为64 s。DCE-MRI检查使用高压注射器经肘静脉团注对比剂Gd-DTPA 20 mL，流率3 mL/s，注射与扫描同步进行，扫描参数：TR 2.7 ms，TE 1.2 ms，共扫描660层，层厚3 mm，矩阵272×160，视野40 cm×36 cm，连续扫描55期，所需时间为183 s。由2位经验丰富的放射科医师对所有研究对象的多模态MRI影像学结果进行判读，所得结论意见出现分歧时通过讨论达成一致。采用GE ADW 4.3工作站Functool软件在T2WI、DWI、DCE-MRI图像上选取显示病灶最明显区域作为感兴趣区(ROI)，注意避开所有干扰因素(坏死、钙化、囊变、出血)的影响，随机测量3次取平均值并记录。通过在ADC图上显示低信号的位置绘制ROI区后自动生成ADC值；DCE-MRI通过绘制时间-信号强度曲线，然后计算出达峰时间(Tmax)、最大强化程度(SImax)及最快强化率(Rmax)等参数。

血清miR-301a水平的测定：抽取研究对象的外周静脉血2 mL，然后于4℃、3000转/min条件下离心10 min，取上清，置于-80℃冰箱内。应用定量实时聚合酶联反应法测定血清中miR-301a的相对表达水平。引物由上海云序生物科技有限公司设计并提供，引物序列如下：上游：5′-ACCTGAGACCGACCATGAT-3′，下游：5'- CGGCACCAGACAGATA-3′；内参基因U6的引物序列如下：上游：5′-CTCTACACCGGGCCGGTA-3′，下游引物为5′- AACGCTTCACGAATCG-3′。反应体系包括0.75μL E×12TaqMan⑧基因表达检测液，7.5 μL TaqMan PCR反应混合液，3 μL cDNA模板，再加ddH2O至15 μL。反应条件为：95℃预变性10 min；94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，共循环40次，然后采用荧光定量PCR仪进行定量测定。采用标准曲线法对miR-301a的表达水平进行相对定量分析，应用2-ΔΔCT法计算结果。

前列腺癌患者临床病理资料的收集及危险度评定：查阅患者病例资料，记录年龄、PSA水平，由高年资病理科医师采用国际泌尿病理学会(International Society of Urological Pathology，ISUP)前列腺癌分级标准进行组织病理学评价，记录TNM分期及Gleason评分。前列腺癌危险程度评定采用国际公认的前列腺癌危险评分系统：低危组，同时满足分期为T1～T2a、Gleason评分2～6分和PSA<10 ng/mL；中危组，满足分期为T2b～T2c、Gleason评分7分、10 ng/mL≤PSA≤20 ng/mL中任一条件；高危组，满足T3a及以上、Gleason评分8～10分、PSA>20 ng/mL中任一条件。

随访及复发判定：术后定期对患者进行随访，随访期间门诊复查PSA水平。首次随访为治疗结束后的第1个月，之后每隔3个月随访1次，共随访2年。复发的判定标准为连续检测2次PSA水平升高，每次升高≥0.2 ug/L的患者即认为复发，否则认为未复发。

3.统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。对于不同观察者的测量值，运用组内相关系数(intraclass correlation coefficient，ICC)对结果的可重复性进行评估，ICC<0.4表明重复性差，ICC在0.40～0.75之间表明重复性较好，ICC>0.75说明重复性很好。符合正态分布的定量资料以均值±标准差表示，组间比较采用t检验；分类资料以频数表示，组间比较采用χ2检验。多模态MRI参数鉴别前列腺癌危险度分级和预测前列腺癌早期复发的效能采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.两组患者多模态MRI参数及血清miR-301a水平的比较

不同观察者对前列腺癌者ADC值测量一致性结果的ICC值为0.89，对良性前列腺增生者ADC值测量一致性结果的ICC值为0.92，均>0.75，提示一致性很好。对于多模态MRI参数，前列腺癌组(图1)的ADC值、Tmax显著低于良性前列腺增生组(图2)，SImax、Rmax显著高于良性前列腺增生组，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表1)。前列腺癌组的血清miR-301a水平显著高于良性前列腺增生组，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

图1 前列腺癌患者，男，73岁。a)ADC图示前列腺占位区呈低信号，平均ADC值为0.87×10-3mm2/s； b) DCE-MRI示病灶呈早期强化； c) 时间-信号强度曲线。 图2 前列腺增生患者，男，66岁。a) ADC图示病灶呈等信号，平均ADC值为1.33×10-3mm2/s； b) DCE-MRI示病灶早期未见明显强化； c) 时间-信号强度曲线。

表1 两组患者多模态MRI参数及血清miR-301a水平的比较

2.前列腺癌高危组与中低危组患者多模态MRI参数和血清miR-301a水平的比较

在前列腺癌患者中，共有27例归为高危组，23例归为中低危组；高危组与中低危组的Tmax和Rmax比较差异无统计学意义(P>0.05)，高危组的ADC值显著低于中低危组，而SImax和血清miR-301a水平显著高于中低危组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 高危组与中低危组间多模态MRI参数和血清miR-301a水平的比较

3.多模态MRI参数及血清miR-301a水平鉴别前列腺癌高危组与中低危组的效能

以前列腺癌危险程度作为状态变量(高危=1，中低危=0)，将ADC值、SImax、血清miR-301a水平及三者联合分别作为检验变量，进行ROC曲线分析。结果显示，ADC值鉴别高危与中低危前列腺癌的AUC为0.659(95%CI：0.505～0.812，P=0.055)，截断值为1.10，敏感度和特异度分别为66.7%和69.6%；SImax鉴别高危与中低危前列腺癌的AUC为0.771(95%CI：0.638～0.904，P=0.001)，截断值为1.66，敏感度和特异度分别为70.4%和73.9%；血清miR-301a水平鉴别高危与中低危前列腺癌的AUC为0.747(95%CI：0.603～0.891，P=0.003)，截断值为2.19，敏感度和特异度分别为70.4%和78.3%；三者联合鉴别高危与中低危前列腺癌的AUC为0.839(95%CI：0.730～0.948，P<0.001)，敏感度和特异度分别为77.8%和78.3%(图3)。

图3 多模态MRI参数及血清miR-301a水平鉴别前列腺癌高危组与中低危组的ROC曲线。 图4 ADC值、血清miR-301a水平及两者联合预测前列腺癌早期复发的ROC曲线。

4.前列腺癌复发与未复发患者基线特征的比较

共有20例前列腺癌患者发生早期复发，30例患者未发生早期复发，两组的年龄、TNM分期、Gleason评分、术前PSA水平及淋巴转移比较差异均无统计学意义(P值均>0.05，表3)。

表3 前列腺癌复发与未复发患者基线特征的比较 (例)

5.前列腺癌复发与未复发患者多模态MRI参数和血清miR-301a水平的比较

共有20例前列腺癌患者发生早期复发，30例患者未发生早期复发。复发组的ADC值显著低于未复发组，而血清miR-301a水平显著高于未复发组，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表4)。

表4 复发组与未复发患者多模态MRI参数和血清miR-301a水平的比较

6.ADC值、血清miR-301a水平预测前列腺癌早期复发的ROC曲线分析

以前列腺癌治疗后是否早期复发作为状态变量(复发=1，未复发=0)，将ADC值、血清miR-301a水平及两者联合分别作为检验变量，进行ROC曲线分析。结果显示，ADC值预测早期复发的AUC为0.700(95%CI：0.551～0.849，P=0.017)，截断值为1.08，敏感度和特异度分别为70.0%和60.0%；血清miR-301a水平预测早期复发的AUC为0.792(95%CI：0.663～0.920，P=0.001)，截断值为2.13，敏感度和特异度分别为75.0%和73.3%；两者联合预测早期复发的AUC为0.813(95%CI：0.689～0.938，P<0.001)，敏感度和特异度分别为80.0%和80.0%(图4)。

讨 论

前列腺癌作为一种发病率较高的疾病，严重危害我国男性人群的生命健康[12]。多模态MRI作为一种非侵入性检查方式，在前列腺癌的诊断中具有重要价值，可实现多参数和多方位成像，具有空间分辨力高、不同组织间的对比度好等优势[13]。DWI可弥补常规T1WI、T2WI的不足，并且对活体组织中水分子的运动十分敏感[2]。DCE-MRI在前列腺疾病的良恶性鉴别诊断中具有重要意义，可通过Tmax、Rmax和SImax这些定量指标反映肿瘤的微循环血流灌注、癌组织信号强度及血管渗透性[14,15]。相关研究表明，血清miR-301a可作为前列腺癌诊断和预后评估的有效生物标志物[10,11]。本研究旨在探讨多模态MRI参数和血清miR-301a在评估前列腺癌危险度和预后中的价值。

本研究结果显示前列腺癌患者的ADC值、Tmax显著低于良性前列腺增生患者，而SImax、Rmax显著高于良性前列腺增生患者，这与之前的研究报道结果一致[5]。ADC值表示水分子运动的自由度，当肿瘤细胞增殖时，细胞外间隙会随之减小，因此ADC值降低。DCE-MRI可反映组织灌注情况，Tmax、 Rmax反映血供进出的速度，Tmax越大表示速度越快，Rmax越小表示速度越快;SImax反映组织最终强化程度，SImax越大表明最终血供量越大。随着肿瘤细胞的增殖，组织微循环灌注能力也会逐渐增强，从而导致Tmax明显缩短，而SImax和Rmax则显著增加。此外，前列腺癌患者的血清miR-301a水平显著高于良性前列腺增生患者，这与Kolluru等[11]报道的结果一致。相关研究表明，血清miR-301a水平在前列腺癌患者中的表达显著升高，可作为前列腺癌患者有效的预后生物标志物[10,11]。

本研究结果显示前列腺癌高危患者的ADC值显著低于中低危患者，SImax和血清miR-301a水平显著高于中低危患者;复发患者的ADC值显著低于未复发患者，而血清miR-301a水平显著高于未复发患者。之前研究显示在恶性程度高、侵袭性强的肿瘤中，血管生成因子产生和释放增多，导致血管生成增多，表现为血供量增加，新生血管壁基底膜不连续，渗透性明显增加，且恶性程度高的肿瘤组织细胞外组织间隙也较恶性程度低的肿瘤组织间隙小，因此水分子自由度降低[16]。相关研究显示前列腺癌患者血清miR-301a水平与Gleason评分、PSA水平密切相关[10]，因此在一定程度上也与前列腺癌患者的危险度和预后有关。笔者采用ROC曲线对多模态MRI参数和血清miR-301a水平评估前列腺癌危险度和预后的效能进行了分析，结果显示，单独应用各MRI参数和血清miR-301a水平评估的效能较为一般，而联合应用MRI参数和血清miR-301a水平评估前列腺癌危险度的敏感度和特异度分别为77.8%和78.3%，预测术后复发的敏感度和特异度分别为80.0%和80.0%，效果较好。

本研究存在以下局限性:首先，本研究样本量较小，可能出现选择偏倚;其次，本研究未根据前列腺癌患者的不同临床病理特征进行分层分析，未来笔者会进一步进行细化研究；最后，不同序列的最明显区域可能存在不一致，难以统一勾画标准，因此可能影响数据的准确性。

综上所述，多模态MRI参数联合血清miR-301a水平在前列腺癌危险程度评估及早期复发预测中具有一定价值。