三维CT定量及定性参数与纯磨玻璃结节样肺腺癌TOP2A、BASP1、FAM72蛋白表达的相关性研究

许双燕，冯涛， 曹宏伟， 曹振东

肺癌在我国的发病率和病死率呈逐年升高趋势[1,2]，近年来，随着人们对健康的重视程度逐渐增高及低剂量CT的广泛开展，肺磨玻璃结节(ground-glass opacity nodules，GGN)的检出率也不断升高[3]。肺腺癌是肺癌病理类型中最常见的一种，相关研究显示，GGN术后病理学检测多表现为腺癌，并遵守一种循序渐进的恶变发展方式[4]。根据GGN内是否含有实性成分，分为纯磨玻璃密度结节(pure ground-glass nodule，pGGN)和混杂磨玻璃密度结节(mixed ground-glass nodule，mGGN)。由于pGGN不含有实性成分，所以相较于mGGN，对于其恶性程度的评价具有一定难度。多项研究表明，基于计算机辅助诊断系统的薄层三维CT定量及定性参数在鉴别诊断pGGN的侵袭性中具有重要价值[5]。随着分子生物学的迅速发展，近年来许多与肺腺癌病理和预后有关的分子标志物成为众多学者关注的重点，如拓扑异构酶2α(Topoisomerase II Alpha，TOP2A)[6]、脑酸溶性蛋白1(brain acid soluble protein 1，BASP1)[7]和序列相似家族72成员(sequence similarity 72，FAM72)[8]。因此，通过对这些分子标志物的表达进行研究，有助于患者预后评估及临床治疗方案的制定。然而，目前需通过获得活体组织标本，结合病理诊断结果才能完成对这些分子标志物的检测，具有一定的滞后性和有创性。影像学检查具有方便、快速、无创等优点[9]，然而目前还未有研究探讨三维CT定量及定性参数在预测TOP2A、BASP1、FAM72蛋白表达中的作用。本研究旨在通过探究pGGN样肺腺癌的三维CT定量及定性参数与TOP2A、BASP1、FAM72蛋白表达间的相关性，以期为术前非侵袭性预测肺腺癌预后以及制定疾病治疗方案提供影像学思路。

材料与方法

1.病例资料

纳入2019年1月-2021年1月在本院初诊并行手术治疗的肺腺癌患者作为研究对象。病例纳入标准：①术前薄层CT扫描结果表现为pGGN，且为单个结节；②术前未行放化疗或其他抗肿瘤治疗；③经两位以上病理学专家确诊为肺腺癌；④未发生纵隔淋巴结转移或远处器官转移。病例排除标准：①薄层CT扫描结果显示实性结节；②合并其他部位恶性肿瘤；③合并其他肺部疾患或有胸廓手术史；④临床病理学或影像学资料不完整。最终，本研究共纳入164例患者，其中男95例，女69例，年龄范围27～81岁，平均年龄(59.41±7.21)岁。本研究获得了医院伦理委员会的支持，所有患者均自愿参与研究并签署了书面知情同意书。

2.检查方法

采用德国Siemens SOMATOM Definition AS+螺旋CT机对患者进行胸部CT扫描。胸部CT扫描范围为肺尖至膈底，扫描参数：管电压120 kV，管电流100～200 mA，矩阵512×512，螺距1.2，层厚7 mm，标准重建层厚1 mm。将所有重建图像传至Siemens后处理工作站(SyngoMMWP VE40A)，应用Siemens三维后处理MM Reading及分析软件Oncology对发现的结节进行处理。在 Oncology上找到相应结节并在结节出现的每层横断面中勾画结节的边界，随后由软件自动获取以下定量参数：结节最长径、体积和平均CT值。定量参数的最终值取2位肺结节诊断经验丰富的影像学医师测量的平均值。此外，在MM Reading上采用多平面重建、最大密度投影、容积再现技术观察结节的形态，得到定性指标，包括分叶征、空泡征、血管集束征、充气支气管征、胸膜牵拉征和瘤肺界面模糊征等。由2位医师共同阅片评估，当结果出现不一致时，通过商讨达成一致。

3.免疫组化方法及判定标准

取术后病理组织标本，采用免疫组织化学检测TOP2A、BASP1、FAM72蛋白的表达水平，试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供。TOP2A主要定位于细胞核，BASP1主要定位于细胞质，FAM72主要定位于细胞质。阳性细胞呈棕黄色，染色程度越深则得分越高，无色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分；染色细胞所占比例越高得分越高，阴性计0分，1%～10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分，最终分值为染色程度得分与染色细胞比例得分相乘得到，<3分认为是低表达水平，≥3分认为高表达水平。

4.统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。定量资料以均值±标准差表示，组间比较采用t检验；定性资料以频数和百分比表示，组间比较采用χ2检验。对单因素分析结果中有统计学意义的因素进一步行多因素二元Logistic分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.病理及免疫组化结果

164例pGGN患者中，浸润性腺癌62例，微浸润腺癌68例，原位腺癌21例，不典型腺瘤样增生13例。其中TOP2A高表达94例(57.3%)，低表达70例(42.7%)；BASP1高表达88例(53.7%)，低表达76例(46.3%)；FAM72高表达96例(58.5%)，低表达68例(41.5%)。

2.TOP2A、BASP1、FAM72蛋白不同表达水平的三维CT指标比较

TOP2A的表达水平与三维CT定量指标中的结节最长径、结节体积和结节平均CT值均显著相关，与定性指标中的分叶征、血管集束征和充气支气管征显著关联。TOP2A高表达者的结节最长径、结节体积均显著高于低表达者，结节平均CT值与低表达者相比显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；TOP2A高表达者中出现分叶征、血管集束征和充气支气管征的比例与低表达者相比显著升高，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 TOP2A蛋白不同表达水平间的三维CT指标比较

BASP1的表达水平与三维CT定量指标中的结节最长径和结节平均CT值相关，与定性指标中的分叶征、血管集束征、充气支气管征和胸膜牵拉征相关。BASP1高表达者的结节最长径显著高于低表达者，结节平均CT值与低表达者相比显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；BASP1高表达者中出现分叶征、血管集束征、充气支气管征和胸膜牵拉征的比例与低表达者相比显著升高，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 BASP1蛋白不同表达水平间的三维CT指标比较

FAM72的表达水平与三维CT定量指标中的结节平均CT值相关，与定性指标中的血管集束征、充气支气管征和胸膜牵拉征相关。FAM72高表达者的结节平均CT值与低表达者相比显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；FAM72高表达者中出现血管集束征、充气支气管征和胸膜牵拉征的比例显著高于低表达者，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

表3 FAM72蛋白不同表达水平间的三维CT指标比较

3.TOP2A、BASP1、FAM72蛋白不同表达水平的多因素二元Logistic回归分析

对三维CT各定性指标(分叶征、空泡征、血管集束征、充气支气管征、胸膜牵拉征)进行变量赋值(无赋值为0，有赋值为1)。分别以TOP2A、BASP1、FAM72蛋白的表达水平为因变量(低表达赋值为0,高表达赋值为1)，以各自单因素分析结果中有统计学意义的变量作为自变量进行多因素二元Logistic分析。结果显示，结节最长径、结节平均CT值和血管集束征是肺腺癌TOP2A高表达的独立预测因子(P<0.05)，结节最长径、结节平均CT值、血管集束征和胸膜牵拉征是BASP1高表达的独立预测因子(P<0.05)，结节平均CT值、血管集束征和充气支气管征是肺腺癌FAM72高表达的独立预测因子(P<0.05，表4、图1～3)。

图1 浸润性肺腺癌患者，女，63岁，TOP2A高表达，左肺上叶结节(箭)，MSCT表现为分叶征、毛刺征。结节大小约2.7cm×2.3cm，CT值约-560HU。 图2 浸润性肺腺癌患者，男，52岁，BASP1高表达，左肺下叶结节(箭)，MSCT表现为分叶征、毛刺征。结节大小约1.4cm×1.9cm，CT值约-320HU。 图3 浸润性肺腺癌患者，女，68岁，FAM72高表达，右肺上叶结节(箭)，MSCT表现为分叶征、毛刺征、胸膜凹陷征。结节大小约3.1cm×2.2cm，CT值约-320HU。

表4 Logistic回归分析结果

4.三维CT定量指标对TOP2A、BASP1和FAM72表达的预测价值分析

对多因素Logistic回归中有统计学意义的CT定量指标进行预后分子标志物的ROC曲线分析，结果显示均有统计学意义(P<0.05，表5、图4)。

图4 a)三维CT定量指标预测TOP2A表达的ROC曲线；b)三维CT定量指标预测BASP1表达的ROC曲线；c)三维CT定量指标预测FAM72表达的ROC曲线。

表5 三维CT定量指标对TOP2A、BASP1和FAM72表达的预测价值

讨 论

近年来，肺癌在我国的发病率居高不下，肺癌的早发现、早诊断及早治疗对提高患者生存率，改善患者预后具有重要意义[10]。迄今为止，肺腺癌的发生、发展机制还未完全明确，近年来，随着分子生物学的迅速发展，许多与肺腺癌病理和预后有关的分子标志物受到了众多研究者的关注[11]。TOP2A通过放松正负DNA 超螺旋来调节拓扑结构，并解决DNA复制和转录过程中的染色体凝聚和染色单体分离，此外，TOP2A在快速分裂的细胞中大量积累，与多种癌症的细胞增殖有关。最近的一项研究显示，TOP2A在肺腺癌组织中表达显著上升，可预测肺腺癌的恶性进展，并且预示着患者预后不良[6]。BASP1是一种膜结合蛋白，相关研究表明BASP1可促进肺腺癌的发生和发展，并且是肺腺癌的潜在治疗靶点，与疾病的预后不良有关[7]。FAM72是一种神经干细胞特异性蛋白质，可能导致有丝分裂后神经元死亡，并可能促进神经元组织以外其他组织癌症的发生和发展。相关研究显示，FAM72肺腺癌细胞的分裂、增殖和分化有关， FAM72水平升高可影响肺腺癌的预后[8]。因此，TOP2A、BASP1、FAM72都是与肺腺癌预后有关的分子标志物，术前通过无创性的三维CT检查，探讨CT征象及定量参数与pGGN样肺腺癌预后分子标志物表达间的相关性，有助于术前无创性评估肺腺癌预后及选择临床治疗方案。

本研究单因素分析结果显示，TOP2A的表达水平与结节最长径、结节体积、结节平均CT值、分叶征、血管集束征和充气支气管征相关；BASP1的表达水平与结节最长径、结节平均CT值、分叶征、血管集束征、充气支气管征和胸膜牵拉征相关；FAM72的表达水平与结节平均CT值、血管集束征、充气支气管征和胸膜牵拉征相关。进一步的多因素Logistic分析结果显示，结节最长径、结节平均CT值和血管集束征是肺腺癌TOP2A高表达的独立预测因子，结节最长径、结节平均CT值、血管集束征和胸膜牵拉征是BASP1高表达的独立预测因子，结节平均CT值、血管集束征和充气支气管征是肺腺癌FAM72高表达的独立预测因子。以上结果表明，三维CT定量和定性参数对肺腺癌预后分子标志物的预测具有重要意义。

之前的研究表明，pGGN的最长径和平均CT值是肺腺癌浸润性的独立预测因素，而肺腺癌的浸润程度越严重，其预后可能越差[12]。传统的二维平均CT值只能单一反映某个层面而难以显示出整个病灶的情况，本研究中采用的三维平均CT值能更全面反映病灶整体情况，并减少偏差。之前的研究显示，血管集束征与pGGN的浸润性有关，pGGN的浸润性越强，癌细胞释放的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等多种刺激因子促血管生成作用则越强，引起血管构形改变，最终导致血管壁因牵拉而出现血管集束现象[13]。相关研究还显示，VEGF等刺激因子与肺腺癌的临床分期及恶性程度有关，VEGF表达升高预示着患者预后不良[13]，因此血管集束征的出现可能与预后分子标志物的高表达有关。胸膜牵拉征的主要病理基础是瘤内纤维化，相对而言，新发肿瘤其病灶内的血管结构缺乏完整性，且血管内皮的间隙较大，因此血液中的纤维蛋白原更容易渗入组织间隙中，从而促进纤维母细胞的生成；此外，恶性肿瘤细胞增殖旺盛，组织内缺氧会导致肿瘤病灶产生纤维化收缩，从而使得牵拉征的发生概率进一步增高[14]。陈威等[15]的研究也显示胸膜牵拉征是预测GGN浸润性的一个重要指标。充气支气管征的发生机理是肺内炎症渗出导致的肺实变改变，周围的肺组织含气量减少，而病变的支气管内含有气体，形成对照。充气支气管征与肺腺癌的浸润程度密切相关，pGGN的恶性程度越高，成纤维细胞对结节内部纤维化反应的刺激越强，会导致支气管被牵拉扩张，同时支气管壁因被肿瘤细胞侵犯而走行僵硬、扭曲。之前的研究表明，肺腺癌组织中FAM72表达升高与结节内部的炎症和纤维化有关[8]，因此充气支气管征的出现可能预示着FAM72的高表达。此外，笔者采用ROC曲线分析了三维CT定量指标对TOP2A、BASP1和FAM72表达的预测价值，结果显示均有统计学意义，结节最长径、结节平均CT值预测TOP2A高表达的敏感度和特异度分别为70.2%、84.3%和72.3%、78.6%，结节最长径、结节平均CT值预测BASP1高表达的敏感度和特异度分别为75.0%、78.9%和63.6%、68.4%，结节平均CT值预测FAM72高表达的敏感度和特异度分别为75.0%和73.5%，因此仅应用三维CT定量指标预测预后分子标志物表达状态的效能中等。

综上所述，三维CT定量及定性参数与纯磨玻璃结节样肺腺癌TOP2A、BASP1、FAM72蛋白表达水平相关，有助于预测患者预后和制定临床治疗方案。