流感疫苗神经氨酸酶含量双抗体夹心ELISA 定量检测方法的建立及应用

邓涛，吕传硕，刘京，马宁，周蓉，张国梅，乐洋，张家友，杨晓明

1.武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室，湖北 武汉 430207；2.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北 武汉 430207；3.中国生物技术股份有限公司，北京 100029

全球每年约有500 万人感染流行性感冒（简称流感），并造成25 万~ 64 万人死亡［1］，接种疫苗是预防流感最有效方法之一。流感灭活／ 裂解疫苗的主要抗原包括血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA），两者均能诱导机体产生保护性免疫反应，目前仍以HA 研究为主，NA 的相关研究较少［2］。NA 在流感病毒传播方面发挥重要作用，其通过水解宿主细胞膜上的唾液酸受体，防止子代病毒在细胞表面聚集，促进病毒颗粒释放，从而使整个病毒复制周期顺利完成［2-3］。近期研究表明，无论是自然感染还是免疫接种产生的NA 特异性抗体均具有独立保护作用［4-5］。临床前研究表明，用NA免疫的动物可抵抗致死剂量流感病毒的攻毒［6-9］。另外，人体的NA 特异性免疫反应也与保护受试者免受病毒感染有关［10-11］。在质量控制方面，若NA和HA 的含量达到病毒包膜上的天然比例，就能够诱导一种平衡反应，从而使疫苗更好地诱导免疫反应［12］。

目前，HA 可采用单向免疫扩散试验定量检测［13］，但尚无用于NA 检测的统一标准和方法，这也成为制约流感疫苗质量评价的瓶颈之一。中国食品药品检定研究院和加拿大卫生部疫苗评价中心利用生物信息学方法分析发现，NA 头部9 个氨基酸（ILRTQESEC）高度保守［14］。本实验将该保守序列与载体蛋白匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联后，分别免疫日本大耳白兔和豚鼠，制备相应通用抗体，建立NA 定量检测的双抗体夹心ELISA 法，并进行验证及初步应用，旨在为流感疫苗生产质控提供一种实用可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 疫苗原液及参考品 流感裂解疫苗H1N1、H3N2、BV 和BY 型单价原液（批号分别为：202010Y014H1、202011Y010H3、202012Y009BV 和202012Y003BY）均由武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室提供，4 种型别（H1N1、H3N2、BV 和BY）的NA参考品由该研究室采用磁珠法纯化制备［15］。

1.2 主要试剂及仪器 HRP 偶联试剂盒、HRP 标记的山羊抗兔IgG、HRP 标记的驴抗豚鼠IgG、Protein A ／ G 混合琼脂糖纯化树脂、两性去污剂（Zwittergent 3-14）和黑底不透明96 孔板均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；普通96 孔板购自美国CoStar 公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂及4-MUNANA购自美国Sigma 公司；显色液购自美国BioLegend 公司；MES 购自国药集团化学试剂有限公司；PierceTMBCA 蛋白定量试剂盒及Multiskan FC 型酶标仪购自美国Thermo Fisher 公司；EnSightTM型荧光酶标仪购自美国PerkinElmer 公司。

1.3 实验动物 清洁级日本大耳白兔（雄性，3~6 月龄，体重2.0 ~ 2.5 kg）和SPF 级豚鼠（雌性，1 ~ 3月龄，体重300 ~ 350 g）均由武汉生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供并饲养，动物生产许可证号为：SCXK（鄂）2017-0013，动物使用许可证号：SYXK（鄂）2014-0012。本实验对兔和豚鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，按照动物伦理相关规定进行，动物伦理审批号为：wibo-All332021001。

1.4 通用抗体的制备 按照参考文献［14］对NA 的保守序列进行修饰，修饰后多肽序列为ILRTQESECAhx-KKC-KLH，由生工生物工程（上海）股份有限公司多肽部合成，采用高效液相色谱分析多肽纯度。将多肽浓度调整为400 μg ／ mL，按1 ∶1 的体积比加入弗氏完全佐剂，经兔及豚鼠背部进行皮下多点免疫，剂量分别为400 和200 μg ／ 只；将多肽按1 ∶1 的体积比加入弗氏不完全佐剂，于初次免疫后2、4、6、8 周进行加强免疫，兔及豚鼠的免疫剂量分别为200 和100 μg ／ 只。末次免疫后2 周，兔和豚鼠分别经颈动脉和心脏采血，分离血清，经Protein A ／ G 亲和层析纯化，获得通用抗体。经12% SDS-PAGE 分析纯度，BCA 法测定浓度。采用HRP 偶联试剂盒制备HRP标记的兔源通用抗体。

1.5 抗体效价测定 采用间接ELISA 法。用包被液（0.05 mol ／ L 碳酸盐缓冲液，pH 9.6）将多肽稀释为5 μg ／ mL，加至普通96 孔板中，100 μL ／ 孔，37 ℃包被2 h；洗涤液（含0.05% Tween 20 的PBS）洗涤3 次，加入封闭液（含5% BSA、0.05% Tween 20的PBS），200 μL ／ 孔，37 ℃封闭2 h；洗涤液洗涤3次，加入兔和豚鼠血清（8 000 ~ 128 000 倍稀释），100 μL ／ 孔，37 ℃孵育1 h；洗涤液洗涤3 次，加入HRP 标记的羊抗兔IgG 或HRP 标记的驴抗豚鼠IgG（均1 ∶8 000 稀释），以未免疫的兔或豚鼠血清作为阴性对照，37 ℃孵育1 h；洗涤液洗涤3 次，加入TMB 显色液，100 μL ／ 孔，室温避光显色15 min；加入终止液（2 mol ／ L H2SO4溶液），50 μL ／ 孔，用酶标仪检测A450。Cut-off 值定义为阴性血清稀释1 000倍后A450的2.1 倍，以高于Cut-off 的最大稀释倍数为相应抗体效价。

1.6 抗体的通用性验证 采用间接ELISA 法。分别采用1 μg ／ mL 的H1N1、H3N2、BV 和BY 型NA 参考品包被，一抗为兔源和鼠源通用抗体，稀释度分别为1 ∶100 ~ 1 ∶12 800 和1 ∶50 ~ 1 ∶6 400，以相应未免疫血清作为阴性对照，其他步骤同1.5 项。

1.7 双抗体夹心ELISA 法的建立 将鼠源通用抗体加入普通96 孔板中，100 μL ／ 孔，37 ℃包被2 h；加入封闭液，200 μL ／ 孔，于37 ℃封闭2 h；洗涤液洗涤3 次，加入NA 参考品或待检样品（参考品用PBS稀释至终浓度20 ~ 640 ng ／ mL，待检样品用含1%两性去污剂的PBS 稀释，室温放置1 h），37 ℃孵育1 h；洗涤液洗涤3 次，加入HRP 标记的兔源通用抗体，100 μL ／ 孔，37 ℃孵育1 h；洗涤液洗涤3 次，加入显色液，100 μL ／ 孔，室温避光放置15 min；加入终止液，50 μL ／ 孔，终止显色，用酶标仪检测A450。

1.8 包被抗体工作浓度及酶标记抗体稀释度的确定采用方阵滴定法［16］，其中包被抗体用包被液分别稀释为32、16、8、4、2、1 μg ／ mL，酶标记抗体稀释度分别为1 ∶50 ~ 1 ∶6 400。以最大Positive ／ Negative（P ／ N）值对应的包被抗体浓度及酶标记抗体稀释度为建立方法的工作浓度及稀释度。

1.9 方法的验证

1.9.1 线性范围 将NA（H3N2 型）参考品用PBS稀释为20 ~ 640 ng ／ mL，采用建立的方法进行检测。以参考品浓度为横坐标，A450为纵坐标，绘制线性回归曲线，并计算相关系数（R2）。

1.9.2 准确度 将NA（H3N2 型）参考品用PBS 稀释为500、200、50 ng／mL，采用建立的方法进行检测，并计算回收率。每个浓度重复检测8 次。

1.9.3 精密性

1.9.3.1 重复性 将NA（H3N2 型）参考品用PBS稀释为500、200、50 ng ／ mL，采用建立的方法重复检测6 次，计算CV。

1.9.3.2 中间精密度 将NA（H3N2 型）参考品用PBS 稀释为500、200、50 ng ／ mL，分别由2 名实验员（A 和B）采用建立的方法进行检测，每个浓度重复检测5 次，计算CV。

1.9.4 耐用性 将体系温度（32、37、42 ℃）、抗原孵育时间（50、60、70 min）及酶标二抗孵育时间（50、60、70 min）3 个条件进行不同组合（保持其中两个条件一致，仅改变1 个条件），见表1。将NA（H3N2 型）参考品用PBS 稀释为500、200、50 ng ／ mL，在不同条件组合下采用建立的方法进行检测，计算样品回收率。

表1 不同检测条件的组合Tab.1 Conditions for determination

1.10 方法的初步应用及与其他方法的比较 采用建立的方法检测H1N1、H3N2、BV、BY 的NA 参考品及流感裂解疫苗单价原液，建立相应标准曲线，计算相应型别流感裂解疫苗单价原液的NA 蛋白含量。同时，采用荧光底物法，即以4-MUNANA 作为酶底物，通过测定NA 催化底物分解后产物的荧光强度，从而测定4 个型别流感裂解疫苗单价原液的NA 活性［17］。并对两种方法检测结果的相关性进行评价。

1.11 统计学分析 应用Microsoft Excel 2019 软件对实验数据建立数据库，SPSS V 21.0 软件进行统计学分析，计量资料以均值± 标准差（x ± s）表示，组间比较采用配对t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 通用抗体的鉴定 合成的保守多肽经高效液相色谱分析，目的峰面积占总峰面积的93.23%，即多肽纯度为93.23%，见图1。纯化的兔和豚鼠血清经12% SDS-PAGE 分析，均可见相对分子质量约50 000 和25 000 的目的蛋白条带（抗体重链和轻链），纯度分别为95%和96%，见图2；抗体蛋白浓度分别为2 339 和1 780 μg ／ mL，效价分别为128 000和64 000。

图1 合成多肽的高效液相色谱图Fig.1 HPLC profile of synthetic peptides

图2 通用抗体的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE profile of universal antibodies

2.2 抗体通用性验证 各稀释度的兔及鼠源通用抗体均能与相应的H1N1、H3N2、BV 和BY 型NA 参考品发生特异性反应，且A450明显高于阴性对照（t=2.420 ～4.856，P 均＜0.05），见表2 和表3。

表2 兔源通用抗体通用性验证结果（A450）Tab.2 Verification for universality of universal antibody from rabbits（A450）

表3 鼠源通用抗体通用性验证结果（A450）Tab.3 Verification for universality of universal antibody from guinea pigs（A450）

2.3 最适包被抗体工作浓度和酶标记抗体稀释度 包被抗体为16 μg ／ mL，酶标记抗体稀释度为1 : 400时，P ／ N 最高（5.0 938），因此选择相应浓度作为方法建立的工作浓度及稀释度，见表4。

表4 最适包被抗体工作浓度和酶标抗体稀释度的确定（P ／ N）Tab.4 Optimization of working concentrations of coating and enzyme labeled antibodies（P ／ N value）

2.4 方法的验证

2.4.1 线性范围 ELISA 检测方法的标准曲线见图3。NA（H3N2 型）参考品浓度在20 ～640 ng ／ mL之间时，与A450呈良好的线性关系，线性回归方程为y = 0.002 x + 0.317 8，R2= 0.996 6。

图3 NA（H3N2）蛋白ELISA 检测方法的标准曲线Fig.3 Standard curve of ELISA for determination of NA（H3N2）protein

2.4.2 准确度 8 次检测500、200、50 ng ／ mL 的NA（H3N2 型）参考品的回收率均值分别为102.15%、100.89%、100.70%，在85% ～115%范围内，见表5。表明该方法具有良好的准确度。

表5 准确度验证结果Tab.5 Verification for accuracy

2.4.3 精密性

2.4.3.1 重复性 500、200、50 ng ／ mL 的NA（H3N2型）参考品经6 次检测的均值分别为（499.91±22.99）、（206.37 ± 14.82）、（50.18 ± 3.22）ng ／ mL，CV 分别为4.60%、7.18%、6.42%，均＜10%，见表6。表明该方法具有良好的重复性。

表6 重复性验证结果Tab.6 Verification for reproducibility

2.4.3.2 中间精密度 实验员A 对500、200、50 ng／mL的NA（H3N2 型）参考品检测的平均值分别为（495.76±29.75）、（201.82 ± 14.01）、（51.65 ± 5.17）ng ／ mL，CV 分别为5.47%、6.34%、10.06%；实验员B 检测的平均值分别为（499.82±14.49）、（197.29±12.41）、（50.95±4.45）ng ／ mL，CV 分别为2.90%、6.29%、8.73%，均＜15%，见表7。表明该方法具有良好的中间精密度。

表7 中间精密度验证结果Tab.7 Verification for intermediate precision

2.4.4 耐用性 不同抗原反应时间及二抗孵育时间条件下，500、200 和50 ng ／ mL 的NA（H3N2 型）参考品样品回收率为85.41%～103.81%，均在85%～115%范围内；但系统温度对反应影响较大，37 ℃上下波动5 ℃时的回收率超出了85% ～115%范围。见表8。表明该方法在系统温度稳定的前提下具有良好的耐用性。

表8 耐用性验证结果（回收率，%）Tab.8 Verification for durability（recovery，%）

2.5 方法的初步应用及与其他方法的比较 H1N1、H3N2、BV、BY 型的NA 参考品标准曲线见图4，线性回归方程分别为y = 0.001 9 x + 0.191 5、y = 0.002 3 x + 0.201 9、y = 0.001 8 x + 0.170 4、y=0.001 7 x+0.208 9，R2分别为0.994 9、0.991 4、0.990 2、0.991 9，均＞0.99。基于各自的标准曲线测得H1N1、H3N2、BV、BY 型流感裂解疫苗单价原液NA 浓度分别为8.06、13.20、6.93、6.18 μg ／ mL。采用荧光底物法测定NA 活性分别为29 833、36 800、28 907、25 871 U／L。两组结果呈正相关（R2=0.979 2），见图5。

图4 4 种型别NA 参考品的标准曲线Fig.4 Standard curves of four types of NA

图5 两种方法检测结果的相关性Fig.5 Relationship between determination results by two methods

3 讨 论

流感疫苗原液中NA 含量的检测可通过SDSPAGE 分析后，用相应毒株的NA 特异性抗体进行Western blot 检测，经扫描灰度的方式对NA 进行半定量。该方法可以粗略地比较不同厂家或不同批次间的NA 相对含量，但不能精确定量NA 蛋白含量。另外，由于NA 具有切割唾液酸的酶活性，与空间结构及免疫原性密切相关，因此酶活性检测在分析疫苗NA 的含量方面具有应用价值。采用唾液酸类似物4-MU-NANA 作为酶底物，特异性与NA 反应并产生荧光物质4-MU，通过检测4-MU 的荧光强度来评价NA 的酶活性［17-18］，酶活性可能在流感疫苗生产（如裂解、超滤、层析等）、储存、运输等过程中损伤NA的四聚体空间结构或一级结构，从而影响酶活性测定。然而损失酶活性的NA 并不一定无免疫原性，因此蛋白定量更能反映疫苗中NA 具体含量。ELISA法具有高通量、高灵敏度、高准确度、操作简便的特点，可以作为一种定量检测NA 含量的理想方法［19］。

本实验制备了兔源和鼠源两种通用抗体，效价分别为128 000 和64 000，纯度分别为95%和96%，蛋白浓度分别为2 339 和1 780 μg ／ mL。基于此建立了用于流感疫苗中NA 含量检测的双抗体夹心ELISA 定量检测法。首先确定了包被抗体最佳工作浓度为16 μg ／ mL，酶标抗体最佳稀释度为1 ∶400。NA（H3N2 型）参考品在20 ～640 ng ／ mL 浓度范围内与A450均具有良好线性关系，R2＞0.99；500、200、50 ng ／ mL NA 参考品的平均样品回收率分别为102.15%、100.89%、100.70%，重复性验证中CV均＜10%，中间精密度验证中CV 均＜15%；耐用性验证中抗原反应时间与二抗孵育时间变化对检测结果影响较小。另外，该方法不会随着每年流感疫苗生产毒株的更换而重新制备NA 毒株特异性抗体，具有更好的实用性。采用建立的方法检测H1N1、H3N2、BV、BY 型流感裂解疫苗单价原液NA 浓度分别为8.06、13.20、6.93、6.18 μg ／ mL，相应酶活性分别为29 833、36 800、28 907、25 871 U ／ L，两者呈正相关（R2= 0.979 2）。

综上所述，本实验建立了基于通用抗体的双抗体夹心ELISA 方法，具有良好的准确度、重复性、中间精密度和耐用性，可作为流感疫苗生产中对NA 质量控制的检测方法。