瑶鸡粪便中乳酸菌的分离鉴定及筛选

金正雨，邓永军，杨泽敏，李双，杨颖

1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025

自从饲料端禁止添加抗生素以来［1］，益生菌作为抗生素生长促进剂的替代物越来越受到关注［2］。联合国粮食及农业组织和世界卫生组织（WHO）对益生菌的定义为“应用适当剂量可有益于宿主健康的活微生物”［3］。在鸡饲料中添加益生菌具有可改变肠道菌群、刺激免疫系统、减少炎症、预防病原体定植、增强生长性能、促进肠道消化率及氨和尿素排泄的作用，在养鸡业上的应用取得了良好效果［4］。传统筛选及分子生物学鉴定是目前筛选益生菌应用较多的方式［5］。传统筛选方法具有操作简单、成本低、可行性高等特点，但同时具有筛选重复性低、工作量大、不能准确鉴定菌株种类等弊端［6］。乳酸菌传统筛选方法为将稀释后样本涂布MRS 固体培养基，对其上生长菌株进行多次传代纯培养，经种属鉴定后进行耐酸和耐胆盐试验。鸡粪中乳酸菌菌株较多，但耐酸和耐胆盐的菌株较少，筛选工作量大。因此，需要对鸡粪便中乳酸菌的分离筛选方法不断改进，以优化实验方案及获得更优质的菌株。

贵州目前推进山地生态畜牧业发展，从江等地大力发展瑶鸡养殖，现存栏25.47 万羽左右［7］。但由于环境阴暗潮湿等原因，贵州生态鸡养殖常见肠炎、鸡球虫病、鸡白痢、鸡大肠杆菌病、鸡霍乱等疫病［8］。使用益生菌是控制肠道等疾病的有效措施。益生菌可调节机体免疫功能、促进肠道微生物稳态及产生益生活性物质，从而增强宿主肠道健康及免疫力［9］。然而益生菌在畜禽养殖应用中存在一定限制［10］，实际应用效果不理想。

本研究从3 月龄健康瑶鸡粪便中分离乳酸菌后，先对菌液进行耐酸、耐胆盐初筛，再进行菌落形态、革兰染色镜检及16S rRNA 基因序列分析，并对分离菌株进行耐酸、耐胆盐、抑菌、生长、产酸性能等试验，为指导乳酸菌作为瑶鸡和其他禽用微生态制剂的研究及其应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株 鸡白痢沙门菌由贵州大学动物科学学院保存。

1.2 主要试剂及仪器 MRS 肉汤、MRS 琼脂、营养琼脂、营养肉汤培养基、牛胆盐、通用基因组DNA 提取试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；2 × Taq PCR、Master Mix、DL2000 DNA marker 均购自天根生化科技（北京）有限公司；紫外分光光度计购自上海康华生化仪器厂；pH 计购自上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 粪便采集及初筛 无菌采集贵州绿源禽业有限公司家禽育种中心成年健康瑶鸡粪便1 g，装至含9 mL 灭菌PBS 的试管中，涡旋振荡器混匀，纱布过滤，取100 μL 滤液接种至200 mL MRS 肉汤中，摇床培养24 h；取培养的菌液，按5%体积比加至PBS（pH 3）中，37 ℃恒温培养箱处理1 h；7 104 × g 离心10 min；用含0.3%胆盐的PBS 重悬，37 ℃恒温培养箱处理1 h；倍比稀释后涂布于MRS 平板上，37 ℃培养过夜；选取平板上生长的优势菌株划线MRS 平板，继续传代纯化3 次，进行革兰染色。

1.4 16 S rRNA 序列分析 挑取上述纯化的单菌落，接种至MRS 肉汤培养基，37 ℃培养12 h；提取细菌基因组DNA 作为模板，利用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，扩增片段大小为1 500 bp）进行PCR扩增。PCR 反应体系为25 μL：2 × Taq Master Mix 12.5 μL；DNA 模板2 μL；27F 2 μL；1492R 2 μL；ddH2O 6.5 μL。PCR 反条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30 个循环；72 ℃终端延伸10 min。PCR 扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果经DNA star lasergene 7.1 软件绘制系统进化树，确定分离菌株分类位置。

1.5 生长曲线和产酸曲线绘制 取100 μL 培养24 h的分离菌株菌液，滴入200 mL MRS 肉汤培养基，37 ℃摇床培养24 h，每隔4 h 取样，采用紫外分光光度计和pH 计检测A600和pH 值。分别以A600值和pH 值为纵坐标，培养时间为横坐标，利用prism Version 8.02（263）软件绘制生长曲线、产酸曲线。

1.6 耐受性试验 将分离菌株培养24 h 的菌液按0.5%体积比分别接种至PBS（pH 3）、含0.3%胆盐的PBS、PBS（pH 6.68，对照）中，37 ℃恒温培养箱静置处理1 h；各组进行活菌计数，计算细菌存活数量。

1.7 抑制病原菌试验 将鸡白痢沙门菌均匀涂布于营养琼脂平板，其上放置4 个牛津杯，同时将37 ℃培养36 h 后的分离菌株菌液经0.22 μm 细菌滤器过滤。在牛津杯孔中分别滴加过滤液和MRS 液体培养基（对照），置4 ℃冰箱24 h，37 ℃恒温培养16 h；观察结果并测量抑菌圈直径。

2 结 果

2.1 初筛菌株形态及镜检 鸡粪滤液经PBS（pH 3）和含0.3%胆盐的PBS 处理，倍比稀释涂布平板，稀释倍数为10-3平板上的细菌种类及数量多于10-4，具有更多不同形态、大小的菌落生长，见图1。挑取上述菌落形态最多的1 种菌株，命名为GZYY2021，经纯化后，取单菌落接种至MRS 肉汤培养基，稀释涂布于MRS 琼脂平板，可见边缘整齐的乳白色菌落生长。挑取菌落经革兰染色镜检，呈革兰染色阳性、球状外观。见图2。

图2 分离菌的形态（A）及革兰染色镜检图（B）（× 1 000）Fig.2 Morphology（A）and Gram staining（B）of isolated bacteria（× 1 000）

2.2 GZYY2021 16S rRNA 基因序列系统进化树分析 GZYY2021 16S rRNA 基因片段大小约1 500 bp，与预期相符，见图3。测序结果经NCBI 比对、绘制遗传进化树，结果显示，GZYY2021 与KAF 131 MT-885272.1（登录号：MT885272）的16S rRNA 基因处在同一分支，同源性达99%以上，可判定GZYY2021为海氏肠球菌，见图4。

图3 分离菌株GZYY2021 PCR 扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoretic profile of PCR product of GZYY2021 strain

图4 GZYY2021 16S rRNA 基因系统发育进化树Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of GZYY2021

2.3 GZYY2021 生长曲线及产酸曲线 GZYY2021在0 ～4 h 处于生长迟缓期，pH 值变化不大；4 h 后进入对数生长期，pH 值迅速下降；8 h 后进入稳定期，pH 值也逐步趋于稳定，最终发酵上清液pH 值接近4.43。见图5 和图6。

图5 GZYY2021 的生长曲线Fig.5 Growth curve of GZYY2021

图6 GZYY2021 的产酸曲线Fig.6 Acid production curve of GZYY2021

2.4 GZYY2021 的耐受性 GZYY2021 经PBS（pH 3）、PBS（0.3% 胆盐）、PBS（pH 6.68）处理后，活菌数分别为1 × 1011、1 × 1010和1 × 1012cfu ／ mL，见图7。表明菌株对酸、胆盐环境均具有一定的耐受能力。

图7 GZYY2021 在不同培养环境下的存活数Fig.7 Survival of GZYY2021 under various conditions

2.5 抑制病原菌效果 3 个平行孔的GZYY2021 对鸡白痢沙门菌均具有抑菌特性，抑菌圈直径均值为18.46 mm，见图8。

图8 牛津杯试验检测GZYY2021 的抑菌效果Fig.8 Oxford cup test for bacteriostatic effect of GZYY2021

3 讨 论

乳酸菌是一种能发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰阳性细菌，具有安全、高效、优质等特点［11］。本研究从瑶鸡鸡粪分离乳酸菌，先利用PBS（pH 3）、含0.3%胆盐PBS、常规PBS（对照）处理进行初筛，采取稀释涂布平板法分离到1 株耐酸、耐胆盐细菌，命名为GZYY2021，继续通过表型特征和革兰染色、16S rRNA 基因序列比对鉴定为海氏肠球菌，为肠球菌属（Enterococus）乳酸菌［12］。有研究表明，海氏肠球菌具有抑菌特性及治疗肠道疾病的功能［13］。龙仲敏［14］取处理鸡粪汁于MRS 液体培养基富集的方法分离到4 种乳酸菌；张博文等［15］则取猪粪稀释涂布于含有碳酸钙的MRS 固体培养基，挑取具有融钙圈的菌株，分别接种选择性溴甲酚绿培养基，选取出现显色反应的菌株，得到1 株乳酸菌。不同来源的实验材料可分离到不同的菌株，而传统分离筛选的方法工作量巨大，因此要不断进行优化改进。

本研究经初筛得到的GZYY2021 在培养8 h 后，菌株生长达到稳定期，24 h 发酵上清液pH 值降到4.43 左右，证明该菌株生长速度快的同时还具有良好的产酸能力。益生菌需通过胃酸环境到达小肠，耐酸性是先决条件；而机体消化吸收的主要场所为小肠，是胆盐环境，因此菌株胆盐耐受性也是重要的筛选指标［16-18］。GZYY2021 在pH 为3.0、胆盐浓度为0.3%的条件下存活数均≥1 × 1010cfu ／ mL，表明该菌株对酸性和胆碱环境耐受能力强。益生菌产生蛋白多肽类、有机酸抗菌物质，能拮抗肠道中病原菌生长，抑制病原菌生长同样也是一种重要的功能性指标。因此，益生菌可用于对肠易激综合征、溃疡性结肠炎等的辅助治疗，对便秘、腹泻等肠道疾病感染及其并发症的治疗和预防［19］。本研究抑菌试验结果表明，GZYY2021 对鸡白痢沙门菌有明显的抑制效果，可为瑶鸡及其他家禽用微生态制剂的研究及应用提供可选择的菌种资源。