两种贝伐珠单抗生物学活性检测方法的对比

邓春平，陈航，王英华，曹迪，俞金泉，刘翠华

百奥泰生物制药股份有限公司，广东 广州 519085

肿瘤生长需要功能性的血管网络提供营养、氧气并清除代谢产物［1］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促进血管内皮细胞的增殖及迁移，是最重要的血管形成因子［2-3］。VEGF 的过度表达已被证实与多种肿瘤的进展有关，因此VEGF 可作为抗肿瘤治疗的重要靶点［2-6］。贝伐珠单抗原研药商品名为Avastin®（中文商品名：安维汀），是由美国Genentech 公司研发的一款重组人源化抗VEGF 单克隆抗体药物，2004 年获FDA 批准上市，用于晚期结直肠癌、非小细胞肺癌、复发难治恶性胶质瘤、转移性肾癌、宫颈癌和卵巢癌等肿瘤的治疗［7-8］。中国也于2010 年批准安维汀上市。随着原研贝伐珠单抗专利到期及临床需求的不断提高，贝伐珠单抗生物类似药的研发成为重点。目前国内外已批准多款贝伐珠单抗生物类似药上市。

生物学活性是生物技术药物有效性评价的关键质量属性，体外活性的检测是保证生物制品有效性的重要质控指标［9-11］，同时也是生物类似药与原研药质量相似性评价的重点［12］。目前贝伐珠单抗的生物学活性检测方法是广泛采用的基于原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的增殖抑制法。该方法存在一些不足，如HUVEC 培养复杂、检测周期长（一般3 ~ 4 d）、检测结果变异性大等［12-13］。由中国食品药品检定研究院开发的荧光素酶报告基因法（reporter gene assay，RGA）完全模拟人体生理状态下VEGF 的信号传导机制，是一种新型转基因细胞生物学活性测定方法，已应用于一些VEGF 靶点生物药物的活性检测［13-14］。本文对HUVEC 增殖抑制法与RGA 法进行全面的对比研究，以评估两种检测方法的性能及可替代性。

1 材料与方法

1.1 贝伐珠单抗 贝伐珠单抗原研药（来自中国、美国和欧洲市场）27 批，均由本公司购入；贝伐珠单抗类似药（包括原液及成品）26 批、贝伐珠单抗活性标准品均由本公司制备。

1.2 细胞 HUVEC 购自美国Sciencell 公司；NFATRE-Luc2P ／ KDR HEK293 细胞由中国食品药品检定研究院提供。

1.3 主要试剂及仪器 EBM 培养基和内皮细胞生长添加剂购自美国Sciencell 公司；重组人VEGF165购自北京义翘神州生物技术有限公司，采用无菌水复溶为浓度100 μg ／ mL 的贮存液；CCK-8 显色液购自日本DOJINDO 公司；Bio-GloTMLuciferase Assay System 购自美国Promega 公司；胎牛血清购自上海ExCell Biology 公司；胰蛋白酶购自美国Gibco 公司；其他试剂均为分析纯；SpectraMax M4 酶标仪购自美国Molecular Devices 公司。

1.4 生物学活性检测

1.4.1 HUVEC 增殖抑制法 HUVEC 经胰酶消化后，用EBM 培养基（含2%胎牛血清）重悬，将细胞密度调整为6 × 104cells ／ mL，接种至96 孔细胞培养板，100 μL ／ 孔，37 ℃，5% CO2培养箱培养5 ~ 6 h。用含2%胎牛血清的EBM 培养基作为稀释液将贝伐珠单抗活性标准品及样品预稀释至20 000、5 000、2 500、1 250、830、556、370、185、92.6 和23.1 ng／mL，同时将VEGF165 贮存液稀释至80 ng ／ mL，取活性标准品／ 样品系列稀释液与稀释后的VEGF165 溶液等体积混合，37 ℃，5% CO2培养箱培养1 h；取100 μL 上述活性标准品／ 样品与VEGF165 混合液，加至接种HUVEC 细胞的培养板中，37 ℃，5% CO2培养箱培养66~72 h；加入CCK-8 显色液，20 μL／孔，37 ℃，5% CO2培养箱孵育4 h；将细胞培养板室温平衡30 min 后，于酶标仪读取各孔A450值。采用SoftMax Pro 软件，以活性标准品／ 样品浓度为横坐标，对应孔A450为纵坐标，进行四参数拟合，绘制抗体浓度-反应曲线，其中拟合的四参数方程的C 值即为EC50值，按下式计算样品相对生物学活性（%）。

相对生物学活性（%）= 活性标准品EC50／ 样品EC50×100%

1.4.2 RGA 法 NFAT-RE-luc2P／KDR HEK29 细胞经胰酶消化后，用DMEM 培养基（含10%胎牛血清）重悬，调整细胞密度至1.25 × 106cells ／ mL，接种至96 孔不透明细胞培养板，40 μL／孔，置37 ℃，5%CO2培养箱培养。用稀释液（含10%胎牛血清、40 ng ／mL VEGF165 的DMEM 培养基）将贝伐珠单抗活性标准品及样品稀释至3 000、1 500、750、375、187.5、93.75、46.88、23.44 和11.72 ng ／ mL，加至接种NFAT-RE-luc2P ／ KDR HEK29 细胞的培养板中，40 μL ／ 孔，37 ℃，5% CO2培养箱培养5 ~ 7 h；细胞培养板室温平衡5~10 min；加入Bio-GloTMLuciferase底物溶液，40 μL ／ 孔；上酶标仪，以化学发光模式读取各孔发光值（RLU）。采用SoftMaxPro 软件，以活性标准品／ 样品浓度为横坐标，对应孔发光值为纵坐标，进行四参数拟合，绘制抗体浓度-反应曲线，其中拟合的四参数方程的C 值即为EC50值，按下式计算样品相对生物学活性（%）。

样品相对生物学活性（%）= 活性标准品EC50／ 样品EC50× 100%

1.5 方法性能对比研究 参照相关文献［13，15］对HUVEC 增殖抑制法及RGA 法分别进行验证，比较两种检测方法的检测性能。

1.6 样品检测对比研究（等效性研究） 采用HUVEC增殖抑制法及RGA 法同时对53 批贝伐珠单抗样品（包括原研药及其生物类似药）进行检测。

1.7 稳定性指示对比研究 取2 批贝伐珠单抗生物类似药样品，在不同的稳定性条件（表1）下处理后，同时采用HUVEC 增殖抑制法及RGA 法进行检测，采用Graph Prism 5 软件绘制降解曲线，比较两种方法的稳定性指示能力。

表1 稳定性研究条件Tab.1 Condition for stability test

1.8 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，比较采用配对t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 方法性能对比 验证结果显示，RGA 法检测周期更短，曲线的R2、信噪比、线性段范围均优于HUVEC 增殖抑制法，检测范围更宽，精密度更高。见图1 和表2。

表2 HUVEC 增殖抑制法及RGA 法的方法性能对比Tab.2 Performances of HUVEC proliferation inhibition assay and RGA

图1 RGA 法（A）与HUVEC 增殖抑制法（B）的浓度-反应曲线比较Fig.1 Dose-response curves of RGA（A）and HUVEC proliferation inhibition assay（B）

2.2 样品检测对比 结果显示，两种方法检测结果差异无统计学意义（t=1.25，P=0.216）。见图2 和表3。表明两种方法的检测结果具有可比性，是等效的。

图2 HUVEC 增殖抑制法及RGA 法检测53 批贝伐珠单抗样品活性结果的比较Fig.2 Activities of 53 batches of Bevacizumab determined by HUVEC proliferation inhibition assay and RGA

表3 53 批贝伐珠单抗样品活性检测结果Tab.3 Determination results of 53 batches of Bevacizumab

2.3 稳定性指示对比

2.3.1 加速稳定性 结果显示，RGA 法测得的生物学活性呈较明显的下降趋势，而HUVEC 增殖抑制法趋势不明显，活性变化拟合曲线的R2值接近0。见图3。

图3 （25 ± 3）℃加速条件下的生物学活性降解趋势对比图Fig.3 Biological activity degradation trends in accelerated stability test at（25 ± 3）℃

2.3.2 强制降解稳定性（65±2）℃高温、（50±2）℃高温、强光照和高pH 条件检测结果显示，两种方法测得的生物学活性均呈现明显下降趋势；其中，两种高温条件下，RGA 法的活性降解速率略快于HUVEC 增殖抑制法；高pH 条件下，两种方法的活性降解速率基本相似；而强光照条件下，HUVEC 增殖抑制法的活性降解速率略快于RGA 法，但RGA法的活性变化拟合曲线的R2值略高，线性略好。低pH 及氧化条件检测结果显示，两种方法测得的生物学活性未呈现明显下降趋势，均在质量标准范围内波动。见图4。

图4 强制降解条件下的生物学活性降解趋势对比图Fig.4 Biological activity degradation trends under forced degradation condition

3 讨 论

抗体与其特异的靶点结合后，通过细胞因子信号的阻断、补体系统的活化、细胞杀伤等生物学作用发挥重组抗体的治疗作用，其生物学活性测定主要是在体外建立相应的细胞评价模型，模拟其作用机制产生客观的全程量效反应，并通过与活性标准品的比较对其生物学活性进行评价［10］。生物技术药物的生物学活性可直接反映其临床治疗的有效性，是生物制品质量控制的重要指标。

贝伐珠单抗的作用机制是与VEGF 特异性结合，阻断其与内皮细胞表面VEGF 受体的结合，从而阻断配体-受体介导的下游信号通路，抑制内皮血管新生、使血管正常化，促进细胞毒性化疗药物的传递并直接作用于肿瘤细胞［16-18］。贝伐珠单抗生物学活性检测广泛采用的HUVEC 增殖抑制法能最大程度模拟抗VEGF 单抗在体内抑制新生血管生成的过程，但该方法存在很多不足，即使经过优化仍不能克服其固有缺陷［12］。近年来，转基因细胞法特别是报告基因法因其检测周期短、方法变异小、信噪比高等特点越来越多应用于抗体药物的生物学活性测定［9，19-22］。中国食品药品检定研究院开发的RGA 法模拟VEGF／VEGFR2 信号转导机制中最主要的PKCCalcineurin-NFAT 信号通路，是一种新型转基因细胞生物学活性测定方法，已用于康柏西普（VEGFRFc 融合蛋白）等生物制品的生物学活性检测［13-14］。

对于利用动物实验或原代细胞等操作复杂、变异性大的传统活性测定方法，在充分了解产品特性及作用机制的情况下，基于新技术和新方法，开发稳定、可靠的活性替代方法用于放行检测或稳定性研究是可行的，其前提是研发者要充分了解产品的质量属性（包括生物学活性等）及药效学关系，开展传统方法与新方法的比较及验证研究，确保产品有效、质量可控［10］。美国注射剂协会（Parenteral Drug Association，PDA）［23］和《美国药典》［24］也指出，生物学活性检测方法如在药物开发过程中，尤其是在关键临床或其后期发生重大变更，应进行全面对比研究，证明变更后方法等效或优于变更前方法。

本研究对比了HUVEC 增殖抑制法与RGA 法的检测性能，同时进行多批贝伐珠单抗的等效性研究及稳定性指示能力检测。对比研究显示，RGA 法检测周期更短，曲线R2值、信噪比、线性段范围均优于HUVEC 增殖抑制法，检测范围更宽，精密度更高；53 批贝伐珠单抗生物学活性两种方法检测结果间差异无统计学意义（P ＞0.05），表明两种方法的检测结果具有可比性，是等效的；稳定性指示对比研究显示，RGA 法在反映热稳定性条件下贝伐珠单抗的生物学活性变化趋势方面略优于HUVEC 增殖抑制法；高pH、低pH 和氧化3 种压力条件下，2 种方法测得的贝伐珠单抗活性变化趋势较一致；而强光照条件下，HUVEC 增殖抑制法测得的贝伐珠单抗活性变化趋势较RGA 法略明显，实验经重复，趋势一致。这可能与强光照条件对抗体造成的复杂影响及2 种活性检测方法原理不完全相同有关；抗体在强光照条件下易形成共价多聚体、片段，产生氧化与脱酰胺等修饰［25］。本实验室研究发现，强光照条件下，贝伐珠单抗重链CDR 区第34 位甲硫氨酸发生氧化修饰比例的升高，而其他稳定性条件未观察到该变化，HUVEC 增殖抑制法可能对这些修饰变化略敏感，但整体活性变化趋势上与RGA 法差异并不明显。综上所述，RGA 法的检测性能优于HUVEC 增殖抑制法，且能更好地反映贝伐珠单抗生物学活性变化，可作为HUVEC 增殖抑制法的替代方法，用于产品的放行检测、稳定性研究及生物类似药与原研药生物学活性相似性评价等。

志谢感谢中国食品药品检定研究院单抗室提供NFAT-RELuc2P ／ KDR HEK293 细胞