19A 型肺炎球菌多糖国家参考品的制备

陈琼，王珊珊，吕雪艳，周学益，韩菲，张亭，叶强

1.中国食品药品检定研究院，北京 102629；2.成都生物制品研究所有限责任公司，四川 成都 610023；3.北京民海生物科技有限公司，北京 102600

肺炎球菌是一种条件致病菌，是侵袭性肺炎球菌疾病和社区获得性肺炎的主要病原菌，也是脑膜炎、菌血症、急性中耳炎和鼻窦炎的常见病因。老人和儿童是肺炎球菌感染高危人群。2015 年，在全球估计的583 万5 岁以下儿童死亡病例中，约有294 000 例［不确定范围（uncertain region，UR）：192 000 ～366 000］是由肺炎球菌感染引起的，另外，估计有23 300 例死亡（UR：15 300 ～40 700）发生在合并感染艾滋病病毒的儿童中［1］。发展中国家的疾病和死亡率高于工业化国家，大多数死亡发生在非洲和亚洲［2］；而且肺炎球菌感染也是导致老年人死亡的主要原因之一［3］。目前，肺炎球菌的耐药性日趋严重，疫苗接种作为有效、经济的预防方式已获得广泛认同［4］。

肺炎球菌荚膜多糖不仅是重要的毒力因子，而且作为肺炎球菌多糖疫苗的活性成分，具有型特异性，目前已发现90 多个血清型［5-6］。活性成分（荚膜多糖）含量测定是保证肺炎球菌多糖疫苗质量有效稳定的一项重要指标。目前，《中国药典》三部（2020版）23 价肺炎球菌多糖疫苗各论中规定，各型多糖含量检测采用速率比浊法［7］，因此，研制用于该方法的荚膜多糖国家参考品尤为重要。本研究制备了19A 型肺炎球菌多糖国家参考品，以期统一衡量不同来源的肺炎球菌多糖疫苗，确保不同企业生产的疫苗肺炎球菌荚膜多糖含量一致。

1 材料与方法

1.1 候选参考品 19A 型肺炎球菌多糖候选参考品（编号：PS19A-2020）由成都生物制品研究所有限责任公司提供。于2018 年9 月，将1 批19A 型肺炎球菌培养上清经收获、杀菌、多糖粗制、多糖精制后，再进行除菌、溶解和分装；分装体积约为0.6 mL ／ 瓶，浓度（精糖粉末重量）为500 ～600 μg ／ mL，分装量约为5 000 瓶，-70 ℃保存。

1.2 标准品、内部质控品及肺炎球菌19c因子血清 19A型肺炎球菌多糖标准品［批号：PN-PV-01Mar2016，20 μg ／（mL·型）］和内部质控品（批号：00118241.0000393）由Merck Sharp&Dohme Corp.，U.S.A 惠赠；肺炎球菌19c 因子血清购自丹麦血清研究所（Statens SerumInstitut，SSI）。

1.3 主要试剂及仪器 UDR、IMMAGE800 缓冲液、IMMAGE800 稀释液、IMMAGE800 洗液及免疫化学分析系统（IMMAGE800 Immunochemistry System）均购自美国Beckman 公司；其他试剂为国产分析纯。

1.4 候选参考品的质量分析 根据《中国药典》三部（2020 版）中23 价肺炎球菌多糖疫苗各论对候选参考品进行质量分析［7］；采用1H 核磁共振法对候选参考品进行型别鉴定，并与文献［8］报道的19A 型肺炎球菌多糖核磁指纹特征图谱进行比较。

1.5 多糖含量协作标定

确定协作标定操作规范，选取中国食品药品检定研究院（编号：01）、成都生物制品研究所有限责任公司（编号：02）及北京民海生物科技有限公司（编号：03）3 家实验室，标定候选参考品的多糖含量。每个实验室至少获得5 个独立数据，每个独立数据为3 个稀释度的均值，每个稀释度需进行2 次平行检测。实验有效性前提为标准曲线相关系数（R2）不小于0.99，且2 次平行测定值的RSD 不大于15%，内部质控品的19A 型多糖含量在35 ～65 μg ／ mL。最终结果为3 家实验室15 个独立数据计算均值及RSD。

1.5.1 仪器参数设置 选择Non-Competitive Neph.模 式，Sample or Dilution Volume 21 μL，Reaction Buffer Volume 300 μL，Compartment A Volume 21 μL，Compartment B Volume 0，Gain 4，Cal Dilution 1 ∶1，反应时间3.5 min。

1.5.2 稀释方案 统一分发多糖标准品、内部质控品、血清和候选参考品给3 家协作实验室。将10 μg ／ mL 标准品用IMMAGE800 稀释液稀释至4个标定浓度（0.75、1.0、1.5 和2.0 μg ／ mL）；内部质控品40 倍稀释；候选参考品稀释方法见表1，选择3 个稀释度供检测。

表1 候选参考品稀释方法（μL）Tab.1 Dilution of candidate（μL）

1.6 分装均匀性评估 随机抽取所需进行均匀性评估的参考品50 瓶，采用IMMAGE800 稀释液将候选参考品稀释至1 ∶500 供检测。

1.7 稳定性评估 将候选参考品分别于2 ～8 ℃放置2、4 和8 周，25 ℃放置3、7、14、21 和28 d，37 ℃放置6 h、1 d、2 d、3 d、7 d 和14 d；反复冻融3 次，以-70 ℃超低温冰箱中保存的参考品作为对照，测定其含量，考察参考品的加速稳定性及反复冻融稳定性。

2 结 果

2.1 候选参考品的质量 候选参考品的各项检测结果均符合《中国药典》三部（2020 版）的标准，见表2。PS19A-20201H 核磁谱图端基质子区各峰的化学位移与19A 型肺炎球菌多糖核磁指纹特征图谱一致，见图1。因此，候选参考品为19A 型肺炎球菌多糖。

图1 19A 型肺炎球菌荚膜多糖600 MHz 1H NMR 端基质子区图谱Fig.1 600 MHz 1H NMR anomeric proton regions of serotype 19A pneumococcal capsular polysaccharide

表2 候选参考品的质量分析结果Tab.2 Quality analysis of candidate reference

2.2 多糖含量协作标定 3 家实验室标准曲线R2均大于99%，各浓度2 次平行测定值的RSD 均小于10%。由3 个稀释度获得每次独立数据的RSD 均小于5%。3 家实验室获得的15 次标定结果的均值为565 μg ／ mL，RSD 为8.56%。内部控制品的多糖含量均符合标准，见表3。

表3 各实验室协作标定结果（μg ／ mL）Tab.3 Collaborative calibration results by various laboratories（μg ／ mL）

2.3 分装均匀性 随机抽取的50 瓶候选参考品19A 型多糖含量在535 ～622 μg ／ mL 之间，均值为586 μg ／ mL，最高值与最低值的RSD 为10.63%，50 瓶多糖含量的RSD 为3.16%，分装均匀性良好。

2.4 稳定性 19A 型多糖在37 ℃下存放3 d，多糖含量从第0 天的620 μg ／ mL 下降至545 μg ／ mL，标准偏差（standard deviation，STD）为9.10%；7 d 时多糖含量为404 μg／mL，STD 为29.83%。25 ℃下存放14 d，多糖含量从第0 天的620 μg／mL 下降至544 μg ／ mL，STD 为9.23%；21 d 时多糖含量为478 μg ／ mL，STD 为18.29%。表明候选参考品于2 ～8 ℃存放8周、25 ℃存放14 d、37 ℃存放3 d，稳定性均良好。反复冻融3 次，稳定性良好。见图2。

图2 稳定性试验结果Fig.2 Result of stability test

3 讨 论

全球第一个23 价肺炎球菌多糖疫苗于1983 年在美国批准上市［9］。2005 年，成都生物制品研究所成功研制了我国首个23 价肺炎球菌多糖疫苗［10］。荚膜多糖作为23 价肺炎球菌多糖疫苗的唯一活性成分，检测各型多糖含量是效力试验的替代指标，也是保证疫苗质量稳定有效的一项重要指标。1983年，LEE 等［11］建立了光散射定量比浊法检测各型多糖含量，目前各型多糖含量检测普遍采用速率比浊法，但缺乏国际标准品，目前我国市场上有4 家企业生产的23 价肺炎球菌多糖疫苗，均采用企业自制参考品。

本研究采用由Merck Sharp&Dohme Corp.，U.S.A惠赠的企业自制参考品（PN-PV-01Mar2016）作为标准品，标定19A 型肺炎球菌多糖候选参考品（成都生物制品研究所有限责任公司生产）。根据《中国药典》三部（2020 版）各论对候选参考品进行质量分析，包括蛋白质、核酸、磷、总氮、氨基己糖、甲基戊糖、分子大小以及细菌内毒素含量，结果均符合《中国药典》三部（2020 版）标准以及国家药品标准，核磁共振结果显示，此候选品为19A 型肺炎球菌多糖。多糖含量协作标定结果显示，速率比浊法检测多糖含量重复性好，6 个独立数据的多糖含量RSD均小于10%，内部质控品的19A 型多糖含量RSD 也均小于15%。分装均匀性评估结果显示，随机抽取的50 瓶候选品19A 型多糖含量的RSD 为3.16%，表明分装均匀性良好。稳定性评估结果显示，2 ～8 ℃存放8 周，25 ℃存放14 d，37 ℃存放3 d，以及反复冻融3 次，稳定性均良好。

综上所述，本实验成功制备了19A 型肺炎球菌多糖国家参考品，并通过协作标定确定了多糖含量，可用于肺炎球菌多糖疫苗中的多糖含量检测。