lncRNA PTENP1 通过miR-142-5p/PTEN 分子轴调控结直肠癌HCT116细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制①

凌旭坤 谢文鸿 张 喆 胡 琛 （惠州市中心人民医院胃肠外科，惠州 516200）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界范围内常见的癌症，其高侵袭性是导致患者死亡的主要原因之一，患者五年生存率低于10%［1］。因此，研究与侵袭转移相关的分子机制具有重要意义。研究发现，肿瘤抑制基因PTEN 的假基因lncRNA PTENP1 参 与 调 控 多 种 肿 瘤 的 发 展 进 程［2-4］。PTENP1 位于 9p 13.3，与 PTEN 的 3'UTR 上游区域存在高度同源性，它可以通过竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）机制结合PTEN 上游 miRNAs 调控 PTEN 的表达［3，5］。例如，PTENP1 通过海绵吸附miR-19b 调控PTEN 的表达，进而抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭［6］。研究发现，miR-142-5p 作为致癌基因在CRC 组织和细胞中高表达，沉默miR-142-5p 显著抑制CRC 细胞增殖和迁移［7］。同时也有研究表明，PTEN 是miR-142-5p的下游靶基因，miR-142-5p 能够通过调控PTEN 发挥其功能［8］。但 PTENP1 通过 miR-142-5p/PTEN 轴调控HCT116 细胞增殖、迁移和侵袭的研究尚未有文献报道。本研究将从细胞水平探讨PTENP1/miR-142-5p/PTEN 分子轴调控HCT116 细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制，为寻找抑制CRC 肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移的手段提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 收集 2015 年 3 月至 2017 年 8 月手术切除的CRC组织和配对癌旁组织22例，样本收集后立刻放入液氮中保存。纳入标准：病理学诊断为CRC，术前未行任何放化疗治疗或辅助治疗；排除标准：病理学诊断为非CRC。本研究经惠州市中心人民医院伦理委员会批准，患者或其家属均签署知情同意书。

1.1.2 试剂和仪器 人正常肠上皮细胞FHC（货号：KCB2017068YJ）及 CRC 细胞系 HCT116（货号：KCB 200706YJ）、SW620（货号：KCB201198YJ）和SW480（货号：KCB200848YJ）购自中国科学院昆明动物所；胎牛血清、RPMI1640 购自Thermo Scientific HyClone 公 司 ；Lipofectamine3000 购 于 Invitrogen 公司；miR-142-5p inhibitor 及 RT-qPCR 引物由北京金唯智生物技术公司合成；Trizol 试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 试剂盒均购自Promaga公司；PTEN及β-actin一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自美国Abcam公司；CCK-8检测试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的RPMI1640培养液培养人正常肠上皮细胞F4C 和CRC 细胞系，培养条件为37 ℃、5%CO2恒温培养。隔天换液1次，细胞融合度达到90%左右进行传代培养。

以对数期HCT116细胞为实验对象，将HCT116细胞传代至6 孔板，待细胞融合度达到60%~70%时，根据Lipofectamine3000说明书将pcDNA3.1-PTENP1、miR-142-5p inhibitor、sh-PTENP1、pcDNA3.1-PTEN 及sh-PTEN混合转染至HCT116细胞。转染48 h后，收集细胞进行后续实验。

1.2.2 RT-qPCR 检 测 PTENP1 和 miR-142-5p 的 表达水平 提取CRC 组织和细胞中的总RNA，逆转录成cDNA。用PIKO Red9 6PCR 扩增仪检测PTENP1和miR-142-5p 的表达水平；引物序列为PTENP1 F：5′-TCAGAACATGGCATACACCAA-3′，R：5′-TGATGACGTCCGATTTTTCA-3′；miR-142-5p F：5'-GGCCCATAAAGTAGAAAGC-3′，R：5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'。反应条件为：95 ℃变性2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40 个循环。以 U6 为内参，用 Piko Real 2.0 软件计算 Ct 值，采用 2-ΔΔCt方法计算相对表达水平。实验重复3次。

1.2.3 Western blot检测HCT116细胞中PTEN的表达水平 收集各转染组细胞，PBS 洗涤2 次后RIPA裂解液提取细胞总蛋白，Lowry 法进行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白条带。使用电转仪将凝胶上的蛋白条带转移至PVDF 膜，转膜封闭后，加入兔抗人PTEN 抗体，4 ℃过夜孵育；次日，TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 室温孵育2 h；化学发光液显色，凝胶成像系统扫描。以β-actin 为内参，采用Image J 图像编辑软件分析条带灰度值。实验重复3次。

1.2.4 CCK-8 检测HCT116 细胞增殖活力 取对数生长期转染细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，使用RPMI1640 培养液制备成单细胞悬液，并调整细胞浓度为5×104个/ml。将细胞悬液接种至96 孔板中，200 µl/孔，37 ℃、5%CO2培养箱培养。分别在培养0 h、24 h、48 h、72 h和96 h后，每孔加入20 µl CCK-8溶液，相同条件下继续培养2 h，然后在酶标仪上检测450 nm处光密度（D）值。

1.2.5 Transwell 检测HCT116 细胞迁移和侵袭能力 用无血清的培养基将4 ℃过夜溶解的Matrigel胶在冰上按1∶7 的比例稀释。并将25µl Matrigel 胶加入Transwell 小室上室，37 ℃无菌保持过夜，确保Matrigel 胶充分聚合。Transwell 细胞迁移实验不铺Matrigel胶。分别收集各组转染细胞，将各组细胞分别加入Transwell 小室上室（1.5×104个/小室），下室中加入650µl含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，常规培养48 h，用棉签擦净上室细胞，PBS 清洗后，结晶紫染色，于倒置相差显微镜下（×200）观察并拍照，随机观察5个视野，拍照计数。实验重复3次。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测miR-142-5p 与PTENP1 和PTEN 的靶向关系 利用生物信息预测网站预测PTENP1 和PTEN 与miR-142-5p 的结合序列，用 RT-qPCR 扩增 PTENP1 和 PTEN 上两者的结合序列，并将该扩增片段插入到pMIR-report 中，构建pMIR-report-PTENP1-WT和pMIR-report-PTEN-WT野生质粒，再利用基因突变技术将结合位点突变，构建突变质粒pMIR-report-PTENP1-MUT 和pMIR-report-PTEN-MUT 突变型质粒。用PTENP1 和PTEN野生质粒、PTENP1 和PTEN 突变质粒和miR-142-5p mimic分别或同时转染293T细胞，37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h，用双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组荧光素酶活性。实验重复3次。

1.3 统计学分析 应用SPSS13.0 统计软件，计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC 组织和细胞系中PTENP1 低表达 采用RT-qPCR 检测CRC组织和细胞系中PTENP1的表达水平，结果显示，CRC组织中PTENP1的表达水平显著低于癌旁组织（P＜0.001，图1A）；PTENP1 在CRC 细胞系（HCT116、SW620和SW480）中的表达水平明显低于正常肠上皮细胞FHC（P＜0.05，P＜0.01，图1B），且HCT116 细胞在3 株CRC 细胞系中表达水平最低（P＜0.01），故选择HCT116 细胞进行后续实验。由此可知，PTENP1在CRC组织和细胞系中呈低表达。

图1 CRC组织和HCT116细胞中PTENP1呈低表达Fig.1 Expression of PTENP1 was down-regulated in both CRC tissues and HCT116 cells

2.2 过表达PTENP1 抑制HCT116 细胞增殖、迁移和侵袭 采用RT-qPCR 检测转染效率发现，过表达PTENP1 后，HCT116 细胞中 PTENP1 表达水平明显高于对照组（P＜0.01，图2A）；CCK-8 检测转染组和未转染组HCT116 细胞增殖活力，结果显示，转染pcDNA3.1-PTENP1 后HCT116 细胞增殖活力明显降低（P＜0.05 或P＜0.01，图2B）；Transwell 检测转染组和未转染组HCT116 细胞迁移和侵袭能力发现，与对照组相比，过表达PTENP1显著下调HCT116细胞迁移和侵袭能力（P＜0.001 或P＜0.01，图2C、D）。由此可知，过表达PTENP1 可抑制HCT116 细胞增殖、迁移和侵袭。

图2 过表达PTENP1 抑制HCT116 细胞增殖、迁移和侵袭（×200）Fig.2 Over-expression of PTENP1 repressed proliferation，migration and invasion of HCT116 cells（×200）

2.3 miR-142-5p 与 PTENP1 和 PTEN 具有靶向关系 PTENP1 和 PTEN 与 miR-142-5p 的结合序列，如图3A所示。双荧光素酶报告基因结果显示，与对照组相比，将 PTENP1-WT 或 PTEN-WT 与 miR-142-5p mimics 共转293T 细胞后荧光素酶活性明显下降（P＜0.01，图 3B）；但将 PTENP1-MUT 和 PTEN-MUT与miR-142-5p mimics 共转293T 细胞后荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05）。在HCT116 细胞中转染pcDNA3.1-PTENP1后，RT-qPCR检测miR-142-5p的表达水平，结果显示过表达PTENP1 显著下调miR-142-5p 的表达水平（P＜0.05，图 3C）；同时Western blot结果显示，PTEN的表达水平明显增加（P＜0.001，图3D）；在HCT116 细胞中转染miR-142-5p inhibitor后，Western blot 结果显示，PTEN 的表达水平也明显增加（P＜0.01，图3E）。由此说明，miR-142-5p 靶向结合 PTEN 或 PTENP1 的 3′UTR；PTENP1 可 能与PTEN竞争性结合miR-142-5p的作用位点。

图3 miR-142-5p与PTENP1和PTEN具有靶向关系Fig.3 miR-142-5p has a targeting relationship with PTENP1 and PTEN

2.4 PTENP1 与 PTEN 竞争性结合 miR-142-5p 抑制HCT116 细胞增殖、迁移和侵袭 采用RT-qPCR 检测各组的转染效率发现，与对照组相比，转染miR-142-5p inhibitor 显著下调HCT116 细胞miR-142-5p的表达水平（P＜0.01，图4A），但共转染sh-PTENP1+miR-142-5p inhibitor、sh-PTEN+miR-142-5p inhibitor、sh-PTENP1+pcDNA3.1-PTEN时，miR-142-5p的表达水平与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。CCK-8 检测各组HCT116 细胞增殖活力发现，转染miR-142-5p inhibitor 显著抑制HCT116 细胞增殖活力（P＜0.05，图 2B）；Transwell 检测各组 HCT116 细胞迁移和侵袭发现，沉默miR-142-5p 显著抑制HCT116细胞迁移和侵袭能力（P＜0.05，图2C）；而共转 sh-PTENP1+miR-142-5p inhibitor、sh-PTEN+miR-142-5p inhibitor、sh-PTENP1+pcDNA3.1-PTEN 能够下调敲降miR-142-5p对HCT116细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01，图2D）。结果表明PTENP1与PTEN 竞争性结合miR-142-5p，进而抑制HCT116细胞增殖、迁移和侵袭。

图4 PTENP1 与 PTEN 竞 争 性 结 合 miR-142-5p 抑 制HCT116细胞增殖、迁移和侵袭（×200）Fig.4 PTENP1 competitively binds to miR-142-5p with PTEN and inhibited proliferation，migration and invasion of HCT116 cells（×200）

3 讨论

越来越多的研究证明，lncRNA 在细胞增殖、侵袭和迁移等多种癌症相关生物学异常行为中发挥重要调控作用［9-10］。例如，lncRNA CASC2 抑制神经胶质瘤细胞生物学行为［11］；lncRNA KAT7 在 CRC 组织中呈低表达，具有抑制肿瘤细胞增殖和迁移作用［12］。文献报道，PTENP1 在子宫内膜癌、膀胱癌、食管鳞状细胞癌等多种癌症中均能够抑制癌细胞增殖、侵袭和迁移等恶性生物学行为［13-15］。例如，过表达PTENP1 能够抑制体外胶质瘤细胞生长和转移［16］；在肝癌中，PTENP1 呈低表达，其可通过 miR-193a-3p/PTEN 通路抑制肝癌细胞迁移和侵袭［4］。本研究发现PTENP1 在CRC 组织和HCT116 细胞中呈低表达，过表达PTENP1能够显著抑制HCT116细胞增殖、迁移和侵袭。

研究表明，ceRNAs在细胞癌变和癌症发展等多种生物过程中发挥重要作用［17］。PTENP1 作为PTEN 的假基因，由于其与PTEN 具有高度同源性，被认为是理想的ceRNA，且能够共享PTEN 上游miRNAs 的作用位点［18］。研究证实，PTENP1 能够通过PTENP1-miRNAs-PTEN ceRNA 机制调控PTEN的表达，从而在多种恶性肿瘤中发挥肿瘤抑制功能［19］。例如，PTENP1 通过海绵吸附 miR-21 调控PTEN 的表达，抑制口腔鳞状细胞癌的增殖［20］。PTENP1 通过海绵吸附 miR-193a-3p 调控 PTEN 的表达，抑制肝癌细胞迁移和侵袭［4］。另外，研究发现，miR-142-5p 在包括CRC 在内的多种肿瘤中异常表达［7，21-23］。例如，miR-142-5p 通过 ERK1/2 信号通路靶向PLA2G16，抑制人骨肉瘤细胞增殖，促进其凋亡［24］；miR-142-5p 通过靶向下调 SDHB 促进 CRC 的发生［21］。此外，大量文献报道，PTEN 在肿瘤发展过程中扮演重要角色，例如，过表达YAP1 通过下调PTEN 诱导乳腺癌细胞生长［25］。同时有研究证实，miR-142-5p 可以通过调控PTEN 的表达影响肿瘤的发展［8，26］。本研究发现 PTENP1 与 PTEN 竞争性结合miR-142-5p 的作用位点；过表达PTENP1 显著下调miR-142-5p 的表达水平，且同时上调PTEN 的表达水平。本实验证实PTENP1 通过靶向下调miR-142-5p 对 PTEN 的抑制作用，进而抑制 HCT116 细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述，lncRNA PTENP1 可以作为CRC 诊断的分子靶标，通过ceRNA机制海绵吸附miR-142-5p，上调PTEN 的表达水平，进而抑制HCT116 细胞增殖、侵袭和迁移。