丹酚酸B 抑制AKT 的磷酸化诱导子宫内膜癌MFE-280 细胞自噬性死亡和细胞衰老

李 君 王倩青 郜智慧 李 力 高明飞 陈贝贝 （新乡市中心医院妇瘤二科，新乡 453000）

子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）是一种常见的妇科恶性肿瘤，发病率呈逐年升高的趋势［1］。目前，EC的发病机制尚不明确，早期EC患者无明显症状，主要采用手术治疗，晚期及复发EC 患者主要采用放化疗法，但其治疗效果一般［2-3］。分析EC 的发病机制，寻找有效的治疗药物，受到了研究者们的广泛关注。丹酚酸B（salvianolic acid B，SAB）是从丹参的干燥根中提取的有效生物活性成分，可由三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合形成，具有抗炎、抗氧化、神经保护、心脏保护、抗肿瘤等多种生物学作用，临床常用于心血管疾病的治疗［4］。近年来研究显示，SAB 可以调节细胞的自噬、凋亡、衰老等过程，在抗缺血-再灌注损伤、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤中均具有重要作用，但SAB 对EC 的作用及其机制尚不清楚［5-6］。因此，本研究探讨了SAB 对EC细胞自噬性死亡和细胞衰老的作用，旨在为SAB 在EC治疗中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 流式细胞仪（FACScan）购自美国Franklin Lakes 公司；多功能酶标检测仪（iMark680）购自Bio-Rad 公司；荧光显微镜购自日本Olympus 公司；SAB 购自上海融禾医药公司，批号190608，纯度＞98%；CCK-8 检测试剂盒购自上海经科化学科技有限公司；LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、自噬相关蛋白 7（autophagy associated protein 7，ATG7）、磷酸肌醇3激酶（phosphoinositol 3 kinase，PI3K）、p-PI3K、丝/苏氨酸激酶（silk/threonine kinase，AKT）、p-AKT 单克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司；β-actin 和辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔IgG购自DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 采用含质量分数为10%热灭活胎牛血清的RPMI1640 培养液培养MFE-280细胞，37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜，然后取对数期细胞制成单细胞悬液继续培养过夜，加入100µl不同浓度的 SAB（终浓度为 0、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10 µmol/L）孵育 24 h，弃培养液，每孔分别加入10 µl CCK-8 溶液，继续培养4 h，检测450 nm波长的吸光度值，计算各组细胞抑制率，根据 SAB 抑制曲线设置SAB 低剂量（0.5 µmol/L）、中剂量（1µmol/L）、高剂量组（2.5µmol/L）。对照组SAB浓度为0µmol/L。

1.2.2 克隆形成实验检测细胞的增殖 取各组对数生长期细胞与相应浓度药物孵育24 h 后，更换为正常培养基继续培养12 d，至大多数单个克隆中细胞数大于50，每孔加入质量分数4%多聚甲醛室温固定10 min 后，采用1%结晶紫染色，观察每孔内细胞克隆形成率。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞的凋亡 取各组与相应浓度药物孵育24 h 的细胞，离心（1 000 r/min，5 min），弃上清，依次加入Annexin V-FITC、propidium iodide，室温避光孵育30 min，上流式细胞仪进行检测。

1.2.4 Western blot 检测细胞自噬相关蛋白表达和PI3K/AKT 的磷酸化水平 取各组与相应浓度药物孵育24 h 的细胞，提取总蛋白并进行蛋白定量，经SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜，室温封闭2 h，加一抗（Beclin1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、ATG7、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT，稀释比例均为1∶1 000）4 ℃孵育过夜，洗膜加二抗（稀释比例为1∶5 000）室温孵育2 h，电化学发光显影，β-actin作为内参，分析对比条带强弱。

1.2.5 免疫荧光检测细胞自噬活性 取各组与相应浓度药物孵育48 h 的细胞，弃培养基，采用质量分数为4%的甲醛固定10 min，加入200 µl Triton-X作用30 min，采用3%牛血清蛋白封闭，加入LC3一抗孵育过夜，加入荧光耦联二抗，37 ℃孵育1 h 后封片，荧光显微镜下观察LC3荧光斑点数。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位 取各组与相应浓度药物孵育24 h 的细胞，2.5%胰酶消化，离心（1 000 r/min，10 min），加入1 mmol/L 的JC-1染色工作溶液1 ml，37 ℃孵育30 min，上流式细胞仪检测荧光强度。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0软件对所得数据进行分析，满足正态分布计量资料均以表示，采用单因素方差分析比较组间差异性，若组间比较有差异，采用SNK-q比较两组间差异性，且差异均以P＜0.05表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 SAB 抑制MFE-280 细胞的剂量筛选 CCK-8结果显示（图1），SAB 对MFE-280 细胞的抑制作用呈药物浓度依赖性，半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为1.040 µmol/L。因此设置SAB 低剂量、中剂量、高剂量组的浓度分别为0.5、1、2.5 µmol/L。

图1 SAB抑制MFE-280细胞的剂量筛选Fig.1 Dose screening of MFE-280 cells inhibited by SAB

2.2 SAB 对MFE-280 细胞增殖的影响 克隆形成实验结果显示（图2），随着SAB 剂量增加，SAB 浓度为 1 µmol/L 和 2.5 µmol/L 时，细胞的克隆形成率明显下降（P＜0.05）。

图2 SAB对MFE-280细胞增殖的影响Fig.2 Effect of SAB on proliferation of MFE-280 cell

2.3 SAB 对MFE-280 细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示（图3），随着SAB 剂量增加，SAB 浓度为 1 µmol/L 和 2.5 µmol/L 时，细胞的凋亡率明显升高（P＜0.05）。

图3 SAB对MFE-280细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of SAB on apoptosis of MFE-280 cell

2.4 SAB 对MFE-280 细胞自噬相关蛋白表达的影响 Western blot 检测结果显示（图4），随着SAB 剂量增加，SAB 浓度为1 µmol/L 和2.5 µmol/L 时，细胞Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和 ATG7 蛋白的表达均明显升高（P＜0.05）。

图4 SAB对MFE-280细胞自噬相关蛋白表达的影响Fig.4 Effect of SAB on expression of autophagy-related proteins in MFE-280 cell

2.5 SAB 对 MFE-280 细胞 LC3 荧光斑点数的影响 免疫荧光实验检测结果显示（图5），随着SAB剂量增加，SAB 浓度为1 µmol/L 和2.5 µmol/L 时，细胞LC3荧光斑点数明显升高（P＜0.05）。

图5 SAB对MFE-280细胞LC3+表达的影响Fig.5 Effect of SAB on expression of LC3+ in MFE-280 cell

2.6 SAB 对MFE-280 细胞线粒体膜电位的影响流式细胞仪检测结果显示（图6），随着SAB 剂量增加，SAB 浓度为1 µmol/L 和2.5 µmol/L 时，线粒体膜电位明显下降（P＜0.05）。

图6 SAB对MFE-280细胞线粒体膜电位的影响Fig.6 Effect of SAB on mitochondrial membrane potential of MFE-280 cell

2.7 SAB对MFE-280细胞PI3K和AKT磷酸化的影响 Western blot 检测结果显示（图7），随着SAB 剂量增加，SAB 浓度为1 µmol/L 和2.5 µmol/L 时，细胞p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT 蛋白表达均明显下降（P＜0.05）。

图7 SAB对MFE-280细胞PI3K和AKT磷酸化的影响Fig.7 Effect of SAB on phosphorylation of PI3K and AKT in MFE-280 cell

3 讨论

EC 是一种上皮性恶性肿瘤，病因复杂，病因尚不明确，临床主要根据患者的病理特征，采用手术辅以放化疗的综合治疗手段，但其治疗效果并不十分理想［7］。SAB 对心、脑、肝、肾等重要脏器均具有重要的药理作用，近年来研究显示，SAB 对胶质瘤、肝细胞癌等恶性肿瘤也有一定的保护作用，但其对EC 的作用尚不清楚［8-9］。本研究分析了不同浓度SAB对EC细胞的作用，发现SAB对MFE-280细胞的抑制作用呈药物浓度依赖性，当SAB 达到1µmol/L及以上可以明显抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，提示SAB 可以以剂量依赖性的方式抑制MFE-280 细胞的增殖活性，诱导细胞凋亡。研究显示，SAB可以参与调控机体自噬、凋亡、衰老等多种信号通路蛋白的表达，发挥其抗肿瘤、心脑血管保护作用［10-11］。因此，本研究进一步分析SAB 对MFE-280 细胞自噬和细胞衰老的影响，旨在探讨SAB 抗EC 的机制，为SAB 的临床应用提供理论依据，同时也为新药的研发提供理论基础。

自噬是一种不依赖Caspase 途径的细胞死亡方式，可以与溶酶体融合为自噬溶酶体，清除细胞内的多余物质，降解细胞内损伤或衰老的细胞器，维持细胞内环境的稳定［12］。本研究中，随着SAB 作用剂量增加，细胞 Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和 ATG7 蛋白的表达均明显升高，LC3荧光斑点数明显升高，提示SAB可以呈剂量依赖性地促进细胞Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和ATG7 蛋白的表达，增强细胞的自噬活性。Beclin1 是一种自噬相关的抑癌基因，与初期自噬吞噬小泡的形成有关，ATG7 可以参与形成前自噬体结构，还可以促进LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转变，提示SAB 可以增强自噬的形成［13-14］。LC3 是一种自噬体标志蛋白，在自噬过程中，LC3-Ⅰ会转变为一种膜结合形式即LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可以很好地反映细胞的自噬活性，提示SAB 可以呈剂量依赖性的增强 MFE-280 细胞自噬活性［15］。CHENG 等［16］的研究显示，自噬性死亡是肿瘤细胞死亡的主要途径之一，过度增强的自噬活性可以诱导肿瘤细胞死亡，从而发挥其抗肿瘤作用。黄小娟等［17］的研究显示，SAB 可以诱导小鼠自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ的表达，减轻肾组织的病理损伤，改善肾组织纤维化，提示SAB 可以通过增强MFE-280 细胞自噬活性，发挥其抗肿瘤作用。

本研究中，随着SAB 作用剂量增加，细胞JC-1红色荧光表达明显下降。JC-1 是一种检测线粒体膜电位的荧光探针，在线粒体膜电位升高时，JC-1可形成聚合物出现红色荧光；在线粒体膜电位降低时，JC-1 为单体出现绿色荧光，提示SAB 可以呈剂量依赖性的地降低MFE-280 细胞线粒体膜电位［18］。线粒体在细胞内能量代谢、细胞凋亡等过程中具有重要的调控作用，是细胞衰老的关键［19］。线粒体膜电位是线粒体膜内外的电位差，研究显示，线粒体膜电位升高可以影响线粒体内ATP 的合成，影响细胞内的能量代谢，影响细胞自噬性死亡、细胞凋亡、细胞衰老等多种病理生理过程［20-21］。SAB 可能呈剂量依赖性地降低MFE-280 细胞的线粒体膜电位，诱导MFE-280 细胞的自噬性死亡和衰老。本研究中，随着SAB 作用剂量增加，细胞内PI3K 和AKT 的磷酸化水平明显下降。PI3K/AKT 信号通路是细胞内调节自噬的重要信号通路，磷酸化的PI3K可以激活下游的Akt，参与调控细胞的增殖、分化、凋亡和衰老等［22］。MA 等［23］的研究显示，SAB 可以通过抑制PI3K/AKT 的磷酸化，改善肾缺血再灌注损伤，提示SAB可能通过抑制PI3K/AKT的磷酸化，调控MFE-280细胞的生物学行为。多项研究显示，阻断PI3K/AKT信号通路可以诱导肿瘤细胞的自噬性死亡，本研究结果与其基本一致，提示SAB 诱导MFE-280 细胞的自噬性死亡可能与抑制PI3K/AKT 信号通路有关［24-25］。

综上所述，SAB可呈剂量依赖性地抑制MFE-280细胞的增殖活性，诱导MFE-280 细胞的自噬性死亡、凋亡和衰老，其作用机制可能与被抑制的PI3K/AKT 信号通路有关，有望应用于临床治疗。但本研究尚处于初步探索阶段，其具体的作用机制尚需进一步验证。