枯草芽孢杆菌DNKAS对分枝列当的防效、安全性及作用机理

崔华星，许俊锋，崔卫东，包慧芳，詹发强，韦龙石，龙宣杞，杨 蓉，史应武,王 宁

(新疆农业科学院 微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室，乌鲁木齐 830091)

列当是列当科(Orobanchaceae) 列当属(OrobancheL.) 多年生、两年生或一年生肉质寄生草本。以吸根寄生在茄科、豆科、亚麻科、伞形科、十字花科等根上，吸收寄主养分、生长激素和水分以维持自身生长[1-2]，造成寄主作物减产甚至绝收。中国新疆由于优异的地理气候条件，从20世纪90年代后期大力发展以番茄为代表的“红色产业”，2016年新疆加工番种植面积6.9万hm2，产量761万t,番茄酱年产160万t，是亚洲最大的番茄生产和加工基地。然而，近年新疆地区加工番茄受列当危害日益严重，每年受列当影响加工番茄的种植面积约为7000hm2左右,严重影响产业发展[3]。

如何减轻列当对作物的危害是世界性难题。目前，常见措施有化学防治(污染环境)、培育抗性品种(影响番茄品质)、种植诱捕和捕获作物(需要轮作倒茬)、人工拔除(轻度地块有效)等[4]。微生物防除由于绿色高效的特点日益受到人们重视[5],关于生防菌的研究主要集中在真菌[6]和放线菌[7]的应用。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)广泛应用于植物病害防治，并取得良好效果，但用于列当防治的研究较少。新疆特殊环境微生物重点实验室前期发现枯草芽孢杆菌DNKAS菌株会抑制分枝列当种子萌发，在此基础上针对生防菌对分枝列当寄生体系的影响进行研究，为日后分枝列当的防除工作提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株为枯草芽孢杆菌DNKAS，由北京达农生物科技有限公司提供；番茄品种：盆栽试验为易感品种‘87-5’，购自新疆天地禾种业有限公司，大田试验为‘亨氏TH1601’，由中粮昌吉番茄公司提供；DNKAS菌粉，由北京达农生物科技有限公司提供，施用剂型为可湿性粉剂，活菌浓度达 1×1011CFU·g-1；人工合成独脚金内酯类似物GR24，购自北京酷来搏科技有限公司；酶活试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.2 菌株DNKAS对分枝列当的盆栽防效测定

培养土配制：土壤过0.5 cm×0.5 cm筛，将过筛土壤、蛭石和草炭按体积比2∶1∶1配制培养土。接种土配制：每千克培养土添加0.25 g分枝列当种子并混匀，备用。取100 g接种土于7 cm×7 cm×11 cm的营养钵中，将长势一致4～6叶番茄苗移入营养钵中，每个营养钵2株番茄，采用灌根方式于移栽当天、第20天、第30天将 5 mL 1×107CFU·g-1DNKAS菌液随水浇入营养钵内，以不加菌液为对照，并加入等量清水，每个处理12个重复，在温度 23～30 ℃、相对湿度 60% 以上的日光温室中培育，按需浇水施肥，并于60 d后统计列当出土情况，计算寄生强度和防治效果。

寄生强度=分枝列当总株数 / 被寄生的寄主株数；防治效果=(对照寄生度-处理寄生度)/ 对照寄生度×100%。

1.3 菌株DNKAS对分枝列当的田间防效测定

选新疆昌吉地区受分枝列当寄生严重地块，供试番茄品种为‘亨氏TH1601’，4月份温室育苗，6月15日移栽，9月12日采收。生防菌DNKAS菌剂施用面积 32 hm2，以不施菌剂为对照，分4次随水滴灌，时间分别为6月15日7.5 kg/hm2、7月3日15 kg/hm2、7月17日7.5 kg/hm2、8月9日7.5 kg/hm2。待番茄生长中期列当出土后，各处理取3个样点采样，每样点取长70 m、宽1.5 m，共105 m2调查分枝列当发生情况，计算寄生强度和防效。采收时每处理取3个样点，每样点取长3 m、宽1.5 m,共计4.5 m2测产，并统计百果质量和病虫果数。

1.4 菌剂对常规作物的生长安全性评价

在温室盆栽条件下，将2 kg培养土装入 25 cm×12 cm×15 cm花盆中，每盆放置甜瓜、棉花、辣椒、向日葵、番茄种子4～6颗，按Z型排布播种，施菌量为1.5 g，以不加菌粉为对照，每个处理3个重复，每两周补充1次菌剂，每盆剂量为0.01 g，45 d后测量加工番茄苗株高、茎粗、叶宽、叶长、根长，通过表观生长指标初步评价菌剂施用的安全性。

1.5 酶活试验

将“1.2”中营养钵试验的番茄苗于9月10日取出洗净，按照南京建成生物工程研究所试剂盒试验步骤测量番茄根部和列当的苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase,PAL)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和抗坏血酸过氧化物酶 (Ascorbate peroxidase,APX)酶活。

1.6 数据处理

试验数据采用SPSS19.0软件进行配对样本t检验，以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 菌株DNKAS对分枝列当的防效

表1、表2分别是温室条件及田间条件测定的菌剂防效结果。数据表明，盆栽条件下，经菌剂处理后，分枝列当寄生数减少15.17，寄生度下降7.58，防治效果达49.7%。大田试验条件下，施用菌剂后分支列当寄生数下降43.07%，寄生度减少43.01%，田间防效可达43.1%,同时，番茄产量增加45.91%，单果质量提高45.89%，病虫果数降低48.5%。因此，枯草芽孢杆菌DNKAS的施用对分枝列当有显著防治作用，可提高番茄产量及果实等级。

表1 DNKAS菌剂对分枝列当的盆栽防效Table 1 Control effect of DNKAS bactericide on Orobanche aegyptiaca pot cultivation

表2 DNKAS菌剂对分枝列当的大田防效Table 2 Control effect of DNKAS bactericide on Orobanche aegyptiaca in field

2.2 菌株DNKAS对常见作物的生长指标影响

为评价田间使用安全性，在温室初步检测菌剂施用对5种常见作物(甜瓜、棉花、辣椒、向日葵和番茄)生长的影响。在播种45 d内，共施菌剂4次。从表3可以看出，菌剂施用对辣椒的株高、茎粗、叶长有促进作用，增加率分别为19.39%、 20.24%、23.28%，菌剂可增加向日葵的叶宽 (4.11%)，番茄的茎粗(20.60%)及叶宽 (20.76%)，棉花的株高、茎粗、叶长、叶宽同样增加显著，分别为19.35%、29.64%、40.11%、 16.29%；同时，对分枝列当的另一寄主植物甜瓜株高、叶宽也有促进作用。整体而言，该菌剂对作物有部分益生作用，植株生长正常，根长指标虽均无正向促进作用，但亦无抑制作用，可初步判断施加菌剂对这5种植物的生长是安全的。

2.3 菌剂对寄生体系防御酶活性的影响

由图1可见，正常寄生情况下，分枝列当植株体内抗性酶活要比番茄根部同类酶活水平高，苯丙氨酸解氨酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶和抗坏血酸过氧化物酶活性分别高出92.48%、 25.84%、84.45%、24.12%。施用菌剂后，分枝列当的这4种酶活依然比根部酶活性高，相比分别高出43.01%、127.93%、41.42%、25.88%。作为全寄生性植物，已报道分枝列当体内分解代谢类酶活整体会高于寄主植株中的相关酶类，本试验表明，此结论也适用于植物的防御酶系。同时，菌剂的施入可降低番茄与列当之间诸如苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性之间的差别，因此相比原体系，可使番茄部分抗性酶活性得到强化，但也会使分枝列当的超氧化物歧化酶得到更多的增强。从寄生体系中单一植株来看，施用枯草芽孢杆菌DNKAS后，加工番茄根部苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶活性与对照相比差异明显，加工番茄根部酶活分别增加7.72%、111.41%、24.24%、 14.06%，分枝列当酶活与对照相比，苯丙氨酸解氨酶增加44.32%、多酚氧化酶增加137.59%、超氧化物歧化酶增加53.53%、抗坏血酸过氧化物酶增加 15.67%。这与先前部分文献认为生防菌剂可提高植物诱导获得性抗性结论一致[8-9]。

表3 DNKAS菌剂施用后作物的生长指标Table 3 Crop growth under treatment of bactericidal agent of DNKAS

3 讨 论

枯草芽孢杆菌对环境有较强的适应性，具有可在植物或土壤中大量繁殖和定殖、竞争营养位点和空间位点、诱导抗性、促生、增产和拮抗等特性，广泛用于植物病害防治[10-11]，拥有作为列当生防菌的潜力。

盆栽试验表明，枯草芽孢杆菌DNKAS通过降低加工番茄根部分枝列当寄生数量，从而提高防除效果。结合新疆特殊环境微生物重点实验室前期工作，枯草芽孢杆菌DNKAS主要是通过抑制分枝列当萌发数量和缩短已萌发分枝列当芽管长度双重作用下，减少列当萌发率和芽管接触到加工番茄根部的概率来增加防除效果。加工番茄移栽1个月内是分枝列当寄生的关键时期，此时菌剂的施用是缓解寄生危害的最敏感时期。

图1 寄生体系的防御酶变化Fig.1 Changes of defense enzymes in parasitic system

在大田试验中，枯草芽孢杆菌DNKAS通过降低分枝列当寄生数量，使加工番茄增产。列当寄生数量和产量是评判生防菌防治效果的关键指标。尖孢镰刀菌Br-2[12]和密旋链霉菌[13]能够减少列当寄生数量，提高防效，使作物增产。本研究中，菌剂通过降低分枝列当出土量，减轻由于分枝列当寄生对加工番茄的影响，使单个果实质量增加，进而增产。病虫果数减少，可能是由于枯草芽孢杆菌对病原菌引起的疾病具有直接和间接的生物抑制作用[14]。

微生物防治具有无残留、不产生耐药性等优点，被认为是最有可能替代化学杀菌剂的方法之一。但生防菌的大量引入不可避免地会影响农田植物的正常生命活动。试验结果显示，菌株DNKAS施用后在一定程度上能够促进5种田间常规作物的生长。但要开发出能够真正在田间使用且对农作物安全、对列当高度致病的生防菌剂，还需要进行模式动物急性毒性试验及对环境微生态影响的试验。

被分枝列当寄生期间，加工番茄和分枝列当酶活力均有所提升，列当体内酶活力高于加工番茄，且酶活力变化趋势与加工番茄根部酶活力变化趋势一致。Aybeke等[15]研究发现镰刀菌通过提高寄主多酚氧化酶活性，消除列当寄生时产生的活性氧以减轻列当危害。Mabrouk等[16]报道根瘤菌提高豌豆中多酚氧化酶和过氧化物酶活性，使豌豆根部产生更多的酚类化合物和木质素进而增强对锯齿列当抗性。加工番茄根部酶活力升高是由于生防菌有助于增加加工番茄根部PAL、PPO、SOD、APX酶活力。列当种子是通过穿透植物根部韧皮部和木质部完成寄生的。在列当种子萌发寄生前，PAL和PPO升高表明枯草芽孢杆菌DNKAS增加了加工番茄细胞壁厚度、组织木质化程度，提高分枝列当芽管穿透加工番茄根部的难度。SOD和APX活性与抗氧化能力呈正相关，活性增加表明菌剂增强了加工番茄的抗逆性。活性氧是致病菌感染的常见副产物[15]。活性氧通过超氧阴离子、过氧化氢自由基、过氧化氢等多种有害自由基干扰细胞内稳态和氧化还原系统，破坏核酸、蛋白质和脂质。APX和SOD能够快速消灭活性氧，阻止有害H2O2水平的积累，因此可防止分枝列当寄生[17-19]。

导致分枝列当根部酶活力总体高于加工番茄根部酶活力，且酶活力变化趋势与加工番茄根部酶活力变化趋势一致的原因尚不明确。目前，尚无对比研究生防菌对寄主与列当之间酶活性变化的报道。Lilach等[20]通过研究寄主与列当之间内生菌群落变化发现，列当寄生植物后，两者内生菌群落变得越来越相似。造成这种现象的原因是内生菌群落可以借助植物体内维管束传播，而列当通过吸器伸入到植物的木质部和韧皮部吸收寄主养分和水分，进而造成内生菌从植物迁移到列当中，使内生菌群落变化趋于相似。列当体内大部分免疫抗性酶活性高于寄主植物，可能由于施用生防菌后植物体内形成免疫刺激信号，列当吸收植物营养代谢时感知到信号并在体内形成响应。

枯草芽孢杆菌DNKAS适应环境能力强，易于培养，防治效果好，可在移苗时随水滴灌用于防治列当，是一种潜在的优秀生防菌。