毛冬青三萜皂苷对动脉粥样硬化大鼠粪便和尿液代谢组学的影响

白荣钰,易欢,邱静文,陈丰连,王莹,陈冰莹,李瑜,张蕾

(1.广州中医药大学中药学院,广东 广州 510006;2.广州中医药大学护理学院,广东 广州 510006)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是脂质长期沉积于血管壁上形成的一种慢性疾病,是冠心病、脑梗死、心绞痛和缺血性中风等心脑血管疾病发生的主要原因[1]。AS发展因素有脂质浸润、血管内皮慢性炎症等,还伴随着宿主代谢物变化。近年来,代谢组学技术应用到心血管疾病上的研究较多,运用代谢组学技术可预测心血管疾病的发生发展,同时为研究药物的效应和作用机制提供了有效的方法。毛冬青为冬青科常绿灌木植物毛冬青IlexpubescensHook.et Arn的干燥根,具有清热解毒、活血通脉、消肿止痛的功效[2]。研究表明毛冬青中主要活性成分是三萜皂苷类[3]。但有实验证明[4],毛冬青三萜皂苷(Ilexpubescenstriterpenoid saponins,IPTS)的口服吸收利用度较低,少量成分入血,这与口服给药具有明显治疗冠心病的作用[5]产生了矛盾。笔者前期研究表明[6]IPTS能调节AS大鼠肠道菌群的结构与功能,这也许能解释其口服吸收利用度低但却具有明显抗AS作用的原因。同时肠道菌群也会参与宿主的代谢,因此本研究通过非靶向代谢组学分析IPTS干预后大鼠粪便和尿液代谢组的变化,以此来研究IPTS的作用机制。

1 材料

1.1 仪器

SpectraMax iD5多功能酶标仪(美国Promega公司);JC-100A生化培养箱(上海和呈仪器制造有限公司);HM340E冷冻切片机(美国Thermo Fisher公司);SII-N14B恒温水浴箱(上海一恒科技有限公司);Bruker 600 MHz AVANCE Ⅲ NMR(德国Bruker公司);DH300涡旋混合器(杭州佑宁仪器有限公司);TDL-80-2B台式冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 药品与试剂

毛冬青(批号:YPB010001)购自广州致信药业股份有限公司,经广州中医药大学张丹雁教授鉴定为冬青科冬青属植物毛冬青IlexpubescensHook.et Am.的干燥根;高脂饲料(由3%胆固醇,0.5%胆酸钠,0.2%丙基硫氧嘧啶,10%猪油,5%白糖,81.3%基础饲料组成)购自北京华阜康生物科技股份有限公司;维生素D3注射液(批号:20190401)购自哈尔滨市道外区宏达动物药品厂;总胆固醇(TC)试剂盒(批号:20190924)、甘油三酯(TG)试剂盒(批号:201909016)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(批号:20190905)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒(批号:20190905)均购自南京建成生物工程研究所;磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)均为分析纯,购自上海麦克林生化科技有限公司;重水[D2O,含0.05% 3-(三甲基甲硅基)氘代丙酸钠(TSP),w/v]购自美国Sigma公司。

1.3 实验动物

雄性SD健康大鼠,SPF级,体质量(180±20)g,由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(粤)2013-0034。动物实验在广州中医药大学实验动物中心SPF级动物房进行,通过广州中医药大学实验动物伦理审查委员会批准(伦理审批号:ZYD-2020-065)。动物饲养在恒温环境(24±2)℃,12 h昼夜交替,自由饮水饮食,适应性喂养1周。

2 方法

2.1 IPTS的制备

将毛冬青饮片打成粗粉,用10倍量水浸泡24 h,浸泡2次,滤过,弃去滤液。滤渣加入10倍量85%～90%乙醇,加热回流提取2次,每次1 h,收集滤液,浓缩,干燥后得提取物粉末。粉末分散于5倍量10%～20%乙醇液中,滤过,弃去滤液,沉淀经干燥后得IPTS。以毛冬青皂苷B1(纯度>98%)为对照品,依据文献[7]采用比色法测定IPTS的含量,得到的标准曲线为y=369.95x-0.052 9(R2=1),计算得IPTS质量分数为81.63%。见表1。

2.2 动物分组及给药方案

健康雄性SPF级SD大鼠30只,正常饲养1周后,随机分为3组,每组10只,分别为对照组、模型组、IPTS组。对照组给予正常饲料,模型组和IPTS组给予高脂饲料，均为8周。模型组、IPTS组大鼠于首次喂养的第3天按照70万U·kg-1的总剂量腹腔注射维生素D3注射液,对照组腹腔注射等体积生理盐水。IPTS溶于0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制成质量浓度为60 mg·mL-1的溶液,超声20 min使其分散均匀。IPTS组从高脂饮食的第1天开始给药,每天按照60 mg·kg-1的剂量灌胃[6],对照组和模型组灌胃等体积的0.5%CMC-Na溶液。

2.3 取材

末次灌胃结束后,将大鼠置于代谢笼中,连续收集8 h的粪便和尿液。粪便-80 ℃保存,尿液3 000 r·min-14 ℃离心10 min,取上清,-80 ℃保存。收集完粪便和尿液后,禁食不禁水12 h,解剖大鼠,腹主动脉取血,血液静置30 min,3 800 r·min-14 ℃离心10 min,分离得到血清。处死大鼠,迅速分离胸主动脉,于4%甲醛溶液中固定。

2.4 TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的测定

取血清按照TC测试盒、TG测试盒、LDL-C测试盒、HDL-C测试盒说明书进行测定。

2.5 缓冲液配制

采用优化过的磷酸盐缓冲液配制方法,参考文献[8],其中TSP用于化学位移定标。

①磷酸盐缓冲液A(适用于粪便样品):用含0.05%TSP(w/v)的D2O配制浓度为0.1 mol·L-1的磷酸盐缓冲液(K2HPO4/NaH2PO4=4∶1,pH=7.4)。

②磷酸盐缓冲液B(适用于尿液样品):用含0.05%TSP(w/v)的D2O配制浓度为1.5 mol·L-1的磷酸盐缓冲液(K2HPO4/NaH2PO4=4∶1,pH=7.4)。

2.6 样品前处理

NMR样品前处理方法参照文献[9]。粪便样品前处理方法:称取大鼠粪便98～102 mg,加入800 μL磷酸盐缓冲液A,涡旋1 min,-80 ℃冷冻20 min,常温解冻20 min,反复3次。低温超声20 s,涡旋10 s,静置30 s,反复循环10次。离心10 min(4 ℃,16 000×g),取上清液650 μL于1.5 mL的离心管中,再次离心6 min(4 ℃,16 000×g),取上清液600 μL于5 mm核磁管中。

尿液样品前处理方法:吸取解冻后的尿液600 μL于1.5 mL的离心管中,加入60 μL磷酸盐缓冲液B,涡旋1 min,离心10 min(4 ℃,16 000×g),取上清液600 μL于5 mm核磁管中。

2.7 NMR数据的采集

粪样和尿样的检测均在Bruker 600 MHz AVANCE Ⅲ NMR仪上完成,调用NOESYID脉冲序列[RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ]压制水峰并对1H-NMR全谱进行采集。尿样的仪器采集参数设置如下:采样温度298 K,采样点数32 K,采样时间2 s,累加次数64次,混合时间80 ms,90°脉冲宽度11 μs,谱宽12 kHz。采用32 K傅里叶变换方法将自由感应衰减信号转为1H-NMR谱图。对粪样的采集用NOESY脉冲序列,其中脉冲宽度10 μs,其他参数同尿样的采集参数。

首先使用MestReNova(Version 6.1.1,Mestrelab Research S.L,Santigao de Compostela,Spain)对粪样和尿样的核磁谱图进行手动相位调整、基线校正,以TSP(δ0.00)为参考进行化学位移定标。

2.8 统计学方法

采用AMIX软件(V2.1,Bruker Biospin,Germany)对NMR图谱进行分段积分处理,积分间隔为0.004。粪样的积分区间为δ0.5～8.5,尿样为δ0.5～9.5。去除粪样中的水峰δ4.56～4.86以及尿样中的水峰δ4.56～4.86和尿素峰δ5.2～6.1。将所得积分数据进行总面积归一化处理。将归一化后的分段积分数据导入SIMCA软件(V13.0,Umetrics,Umea,Sweden)进行多变量统计分析,包括主成分分析(PCA)、正交化偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。

对已建立模型的有效性和可靠性进行排列验证。排列验证可通过已知数据变量X对预测变量Y进行多次迭代分析,以此来判断模型的可靠程度。若重排后的R2和Q2值均低于原模型的R2和Q2值,则说明模型成立,反之则不成立。

3 结果

3.1 大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量

与对照组比较,模型组TC、TG和LDL-C含量明显升高(P<0.01),HDL-C含量明显降低(P<0.01)；与模型组比较,IPTS组TG含量降低(P<0.05),HDL-C含量升高(P<0.05),结果见图1。

注:与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,

3.2 粪样与尿样代谢物的多元统计分析

3.2.1 模型组与对照组差异比较 如图2～3所示,对照组和模型组大鼠粪便和尿液的样品点在PCA和PLS-DA得分图中完全分离,说明与对照组比较，模型组大鼠体内的代谢物发生了显著变化。200次排列验证图也证明该模型有效,因而进一步进行OPLS-DA分析,结果表明2组大鼠粪便和尿液的代谢物均有较好的分离趋势。

图2 对照组与模型组粪样1H-NMR谱图的PCA得分图(A)、OPLS-DA得分图(B)、PLS-DA得分图(C)以及PLS排列实验验证图(D)Fig.2 PCA scores plots (A), OPLS-DA scores plots (B), PLS-DA scores plots (C), and PLS permutation test plots (D) for the 1H-NMR data of fecal samples between control and model groups

3.2.2 IPTS组与模型组差异比较 如图4～5所示,IPTS组与模型组大鼠的粪便和尿液的样品点在PCA和PLS-DA得分图也能分离,说明2组代谢物有所差异。200次排列验证图也证明该模型有效,OPLS-DA得分图也表明2组大鼠粪便和尿液的代谢物均有较好的分离趋势。

图3 对照组与模型组尿样1H-NMR谱图的PCA得分图(A)、OPLS-DA得分图(B)、PLS-DA得分图(C)以及PLS排列实验验证图(D)Fig.3 PCA scores plots (A), OPLS-DA scores plots (B), PLS-DA scores plots (C), and PLS permutation test plots (D) for the 1H-NMR data of urine samples between control and model groups

图4 IPTS组与模型组的粪样1H-NMR谱图的PCA得分图(A)、OPLS-DA得分图(B)、PLS-DA得分图(C)以及PLS排列实验验证图(D)Fig.4 PCA scores plots (A), OPLS-DA scores plots (B), PLS-DA scores plots (C), and PLS permutation test plots (D) for the 1H-NMR data of fecal samples between IPTS and model groups

图5 IPTS组与模型组的尿样1H-NMR谱图的PCA得分图(A)、OPLS-DA得分图(B)、PLS-DA得分图(C)以及PLS排列实验验证图(D)Fig.5 PCA scores plots (A), OPLS-DA scores plots (B), PLS-DA scores plots (C), and PLS permutation test plots (D) for the 1H-NMR data of urine samples between IPTS and model groups

3.3 差异代谢物筛选

通过差异倍数(Fold change,FC)方法对差异代谢物进行筛选,将同时满足FC>1.2或FC<0.83且独立样本t检验中P<0.05的内源性代谢物作为差异代谢物。各组的差异代谢物汇总如表2所示。差异代谢物主要参与氨基酸代谢、能量代谢、核苷酸代谢以及肠道菌群共宿主代谢。模型组与对照组差异明显,有较多差异代谢物,粪便样本有18种,尿液样本有19种;经IPTS干预后,参与基础代谢的部分内源性代谢物含量得到了回调。

表2 大鼠粪样和尿样中差异代谢物汇总Table 2 The summary of the differential metabolites between the feces and urine samples in rats

3.4 代谢通路分析

由于机体内代谢过程复杂,为进一步探明AS所干扰的代谢通路以及IPTS作用机制,将模型组与对照组以及IPTS组与模型组的差异代谢物数据分别导入MetaboAnalyst4.0中,分别得到造模后与IPTS干预后的代谢通路图。其中造模后受到影响的代谢通路有16条,IPTS干预受到有影响的代谢通路有12条,结果见图6～7。分析受影响的代谢通路,结果表明差异代谢物主要参与氨基酸代谢、能量代谢、核苷酸代谢和肠道菌群共宿主代谢,并绘制相关代谢通路图(图8～9),以直观地反映造模和IPTS干预后机体的代谢变化。

图6 造模后的粪样(A)和尿样(B)代谢通路图Fig.6 Metabolomics pathway analysis for fecal(A) and urine(B) samples after modeling

图7 IPTS干预后的粪样(A)和尿样(B)代谢通路图Fig.7 Metabolomics pathway analysis for fecal(A) and urine(B) samples after the intervention of IPTS

注：↑.上调;↓.下调;黑色字体.未检测到的代谢物;绿色字体.检测到的差异代谢物图8 造模后差异代谢物参与的代谢通路图Fig.8 Involved metabolomics pathway analysis of differential metabolites after modeling

注：↑.上调;↓.下调;黑色字体.未检测到的代谢物;绿色字体.与造模后检测到的差异代谢物相同;棕色字体.得到纠正的代谢物;黄色字体.给药后引起新变化的代谢物图9 IPTS干预后差异代谢物参与的代谢通路图Fig.9 Involved metabolomics pathway analysis of differential metabolites after the intervention of IPTS

4 讨论

本研究对造模后和药物干预后的AS大鼠粪便和尿液进行NMR代谢组学分析,筛选出模型组与对照组、IPTS组之间的差异代谢物,并分析受到影响的代谢通路。结果表明,AS引起的代谢变化包括能量代谢和核苷酸代谢受到抑制、氨基酸代谢受到干扰以及肠道菌群共宿主代谢紊乱。IPTS干预后部分差异代谢物得到回调。参与核苷酸代谢和氨基酸代谢的差异代谢物中,IPTS干预后,主要是尿液中的部分差异代谢物得到回调;而参与能量代谢和肠道菌群共宿主代谢的差异代谢物中,IPTS干预后,尿液和粪便中的部分差异代谢物都得到回调。

与对照组相比,模型组中粪便的富马酸盐和琥珀酸盐含量减少，乳酸含量增加，尿液的琥珀酸盐和2-氧戊二酸含量减少，这些代谢产物都参与能量代谢过程。其中,乳酸是体内三羧酸循环的中间产物,也是糖酵解的最终产物,其代谢异常是能量代谢紊乱的标志[10],表明AS大鼠的糖酵解失衡,三羧酸循环紊乱,机体能量代谢异常。经IPTS干预后,粪便中富马酸盐含量增加,尿液的柠檬酸盐、2-氧戊二酸含量增加,表明能量代谢紊乱得到一定的改善。

与对照组相比,模型组中粪便的腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤核苷含量减少。嘌呤代谢途径的最终产物是尿酸,次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下可以转化成尿酸[11]。尿酸会激活肾素-血管紧张素系统,导致血管平滑肌细胞增殖,从而加剧AS[12]。嘌呤类产物下降说明核苷酸代谢受到扰乱,尿酸代谢异常。经IPTS干预后,尿液中胞嘧啶和黄嘌呤含量增加,表明核苷酸代谢紊乱有所改善。

胍基乙酸酯是甘氨酸的中间代谢产物,也是肌酸合成的直接前体,在酶的作用下生成肌酸,这一反应会造成同型半胱氨酸水平的升高,而同型半胱氨酸则是引发AS的危险因素[13]。模型组粪便中胍基乙酸酯含量增加,提示AS大鼠病情的加剧。有研究表明[14],色氨酸与犬尿氨酸均可扩张冠状动脉血管,并具有降低血压的作用。模型组尿液中色氨酸与犬尿氨酸含量减少,表明AS大鼠血管收缩,促使斑块形成。IPTS干预后,尿液中犬尿氨酸、吲哚-3-乙酸和4-氨基丁酸酯含量得到回调,提示IPTS对AS大鼠的部分氨基酸代谢有所改善。

肠道菌群的代谢物，如胆碱、甜菜碱、TMAO以及短链脂肪酸(SCFAs)和AS密切相关。机体内过量摄入的胆碱会被代谢产生气体TMA,随后TMA在酶的作用下转化成TMAO[15]。有研究表明[16],TMAO可抑制胆固醇逆向转运途径,使胆固醇和胆汁酸代谢发生变化,促进更多的泡沫细胞形成。甜菜碱是L-肉碱到TMAO的代谢中间产物,可加速小鼠的AS形成[17]。SCFAs是肠道内膳食纤维经厌氧菌发酵的产物,主要包括甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等。丙酸可降低胆固醇水平,丁酸可减少炎症,抑制泡沫细胞形成[18]。模型组粪便中胆碱含量增加,丙酸和丁酸含量减少,尿液中TMAO和甜菜碱的含量增加,表明模型组大鼠的肠道菌群宿主共代谢受到扰乱。经IPTS干预后,粪便中丁酸含量增加,尿液中TMAO含量减少,提示IPTS对AS大鼠的肠道菌群宿主共代谢有一定的调节作用。

总之,本研究从代谢组学角度分析AS大鼠粪便和尿液代谢物的变化,结果表明IPTS对部分粪便和尿液差异代谢物有调节改善作用,对AS大鼠的代谢紊乱一定的预防和改善作用。本研究为探索IPTS对宿主代谢的作用机制提供了数据基础。