3种消毒剂对早期卤虫幼体的毒性研究

蒋湘，吕美霞，许乐乐，朱文燕，魏亦彤，王锂韫，陈道海*

（1.岭南师范学院生命科学与技术学院，广东 湛江 524048；2.广东省粤西海鲜资源可持续利用工程技术研究中心，广东 湛江 524048）

卤虫（）又称盐水丰年虫、丰年虾、盐虾或鳃足虫，为广温耐高盐型甲壳动物，属于节肢动物门，甲壳亚门，鳃足纲，无甲目，盐水丰年虫科，卤虫属（）。其分布广，世界各地沿海高盐水域、海岸盐田及内陆盐湖等均有分布。中国主要产地为长江以北沿海及内陆等地，天津长芦盐场是最著名的卤虫产地。卤虫具有较高的经济价值与科研价值。卤虫生长迅速，繁殖周期短，幼体与成虫富含蛋白质、脂肪酸和矿物质等营养物质，是海水养殖的优良饵料和天然诱食剂。卤虫能滤食盐田中的藻类和固体悬浮颗粒，改良水质，提高产盐质量。卤虫因其生活习性和生理结构，常用于环境污染物评价和生态毒理学研究，被列为标准实验生物。

无节幼体期的卤虫存活率较低，养殖过程中容易受水体中原生动物（纤毛虫、轮虫）及携带的细菌病毒等感染，饵料投喂前，需定期对其培养水体进行消毒。高锰酸钾（KMnO、甲醛（HCHO）和强氯精（TCCA）是一类常用的消毒剂，可以杀灭各种原生动物、病原微生物与细菌等，在水产养殖中应用广泛，但是用量超过药物安全浓度会导致养殖动物出现中毒甚至死亡。陈婕以美国旧金山大盐湖品系为材料研究了HCHO对卤虫I期无节幼体的毒性，通过拟合回归曲线计算出半致死浓度；刘淇等研究了TCCA等7种消毒剂对北方卤虫幼体的急性毒性；于利等研究了KMnO等4种消毒剂对山西两性卤虫不同发育时期耐受力的影响；李玉全以河北盐田卤虫为材料研究抗菌药物恩诺沙星对卤虫无节幼体的急剧毒性等。以上研究多集中在中国内陆地区，利用人工配置海水来开展毒理研究，而在广东沿海地区利用卤水（天然海水析出盐晶过程中，浓缩形成的高浓度的海水）开展卤虫毒性研究的报告较少。现开展3种消毒剂对卤虫早期幼体毒性的研究，利用概率单位法估算3种消毒剂的半致死浓度与安全浓度，以期为南方沿海卤虫养殖及海水增养殖中合理使用消毒剂提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点与材料

试验地点位于湛江岭南师范学院水生动物实训基地内。所用卤虫休眠卵由湛江海神生物科技发展有限公司提供，卤虫卵化时间28～30 h，孵化温度27℃，光照2 000 lx，盐度3.0%，ρ（溶解氧）＞7 mg/L，孵化密度0.5 g/L，全程持续增氧。孵化卤水来自湛江坡头区南三岛南三盐场，卤水盐度5.8%，释稀盐度至3.0%使用。试验用水进行过滤、消毒、曝气、沉淀、增氧处理。孵化前淡水浸泡30 min左右，08：00开始孵化，次日12：00于恒温光照培养箱中开始毒理试验。容器为直径11 cm、高3 cm的圆柱形食品级塑料桶，有效水体积200 mL。试剂为KMnO分析纯，有效含量99.9%）、HCHO（分析纯，质量分数37%）、TCCA（三氯异氰脲酸粉TCCA，含有效氯30%）。溶液的配制方法为：用天平称取一定质量的KMnO、TCCA，用去离子纯净水配制KMnO母液质量浓度1 g/L（现用现配）、TCCA母液质量浓度1 g/L（现用现配），定容500 mL，HCHO溶液浓度直接配制。

1.2 试验设计

按水生动物毒理学试验方法开展预试验。按等比间距设置浓度区间，找到3种消毒剂对卤虫的24 h全死亡浓度和48 h全存活浓度，再根据浓度区间上下限按等对数间距设置浓度梯度，开展正式试验。KMnO浓度区间为1.00～256.00 mg/L，HCHO浓度区间为800.00～6 400.00 mg/L，TCCA浓度区间为16.00～128.00 mg/L。1个浓度梯度设置3个平行组，1种消毒剂设置3个对照组，每组放卤虫幼体30只。试验开始后不充气、不换水、不投喂。分别于6，12，24，48 h观察幼虫的存活状态，统计死亡幼体数量并用吸管吸出死亡幼体，计算所有试验组的平均死亡数。毒性试验重复2次。死亡卤虫幼体判断标准为幼体沉于底部，且碰触其附肢10 s没有反应。

1.3 数据分析

用SPSS 21.0软件处理数据，建立概率单位-质量浓度的直线回归方程，并绘制出根据模型拟合的毒性预测回归曲线，估算KMnO、HCHO、TCCA对卤虫幼体的24和48 h半致死浓度值（LC及95%置信区间。试验中对照组出现死亡的数据利用SPSS概率回归分析中的校正功能进行校正，做回归直线拟合，在自然响应频率选项Value值中填入对照组死亡数。安全浓度（SC）计算公式：

2 结果与分析

2.1 消毒剂对卤虫的毒性

试验中发现卤虫对3种消毒剂的中毒症状不完全一致。卤虫接触低浓度消毒剂6 h后，死亡数量很少，大部分个体活动正常，与对照组无明显差异；12 h后，部分个体表现出游动缓慢，趋光性减弱，附肢摆动频率变慢等现象；24 h后，部分个体沉入水底，附肢有微微摆动，少量个体已经死亡。3种消毒剂对卤虫毒性试验结果见表1。由表1可见，随着消毒剂浓度的提高，卤虫死亡数量明显上升，在试验的起始浓度时，卤虫24和48 h均无死亡个体；在最终浓度时，卤虫24 h死亡率均达到100%。配对样本双侧检验表明，每种消毒剂的24与48 h平均死亡数存在显著差异（＜0.05）。

表1 3种消毒剂对卤虫毒性试验结果

2.2 概率单位回归分析

2.2.1 拟合回归方程

用概率单位法分析拟合KMnO、HCHO和TCCA对卤虫急剧毒性影响的线性回归方程如下。回归方程Pearson拟合优度检验值均大于0.15，说明模型拟合较为理想。式中：PROBIT为对应的概率单位应变量值；lg（浓度）为对应药物浓度的对数。

2.2.2 LC和SC估算

通过以上拟合的回归方程估算LC及浓度95%的置信区间，求得3种消毒剂的SC。LC通过SPSS分析中概率单位法计算得到。KMnO对卤虫幼体的24和48 h LC为21.333和9.003 mg/L；HCHO对卤虫幼体的24和48 h LC为2 698.019和1 671.508 mg/L；TCCA对卤虫幼体的24和48 h LC为45.217和33.788 mg/L；KMnO、HCHO和TCCA的SC分别为0.481，192.467和5.660 mg/L。根据SC大小来确定敏感的顺序，SC越小，越敏感。卤虫幼体对3种消毒剂的敏感度从高到低依次为KMnO、TCCA、HCHO。

3 讨论

本试验设计方案及试验结果，均符合水生生物急剧毒性试验质量控制要求，对照组死亡率≤10%；试验组中有≤37%和≥67%组存在；试验需设置至少5个及上的浓度梯度；用相同配制的溶液、相同的试剂、相同的操作方法得到的2次重复试验结果之比小于2。

LC的计算方法较多，国内普遍采用的方法有3种，即改良寇氏法、概率单位法（Bliss法）和线性回归法。本试验通过Bliss法研究3种消毒剂对卤虫的毒性效应，拟合回归直线求得LC与SC，进一步提高试验结论的准确性与可信度。

3.1 KMnO4对早期卤虫幼体的急剧毒性效应

KMnO为一种强氧化剂，在水产养殖上应用广泛。KMnO通过与有机体接触，快速氧化酶蛋白及其中的活性基团（如-SH巯基团等），因此常用来给有效水体杀菌、消毒，去除原生动物等，但高浓度的KMnO会导致水生动物死亡。目前，关于KMnO对水生动物的毒性研究报道较多，多种水生动物的KMnOSC已经用于指导实践。如凡纳滨对虾、斑节对虾和中国龙虾的KMnOSC分别为0.28，0.48和1.32 mg/L，双齿围沙蚕和中华绒螯蟹的SC分别为1.40和0.15 mg/L。于利等研究了KMnO等消毒剂对山西两性卤虫不同发育时期的影响，表明卤虫对KMnO的SC≤1 mg/L。本研究得到KMnO对卤虫幼体的24和48 h LC分别为21.333和9.003 mg/L，KMnOSC为0.481 mg/L，与于利等及其他水生动物指导SC相近。

3.2 HCHO对早期卤虫幼体的急剧毒性效应

HCHO是一种广谱杀菌消毒剂，主要是通过烷基化反应使蛋白质变性，从而来杀灭病原微生物，对细菌、芽孢、真菌及原生动物均有较强的杀灭作用，持续时间较其他消毒剂长，在水产养殖中常应用于受精卵、幼体、虾苗及卤虫无节幼体等的消毒，育苗水处理以及原生动物等寄生虫病害的防治等，对凡纳滨对虾和斑节对虾仔虾的SC为2.62和3.56 mg/L。生产中用150~200 mg/L的HCHO消毒对虾无节幼体，浸泡30~60 s，用于防治日本囊对虾等养殖中出现的钟形虫及聚缩虫病。在卤虫孵化过程中，可用HCHO对收集的无节幼体进行消毒。陈婕研究HCHO对美国旧金山大盐湖卤虫I期幼体的毒性效应，得到24 h LC为1 590 mg/L。张文博等以美国大盐湖的卤虫为受试生物，评估HCHO对水环境的毒性，24和48 h LC为16.765和4.783 mg/L。本研究中，HCHO对卤虫幼体的24和48 h LC为2 698.019和1 671.508 mg/L，SC为192.467 mg/L，高于陈婕、张文博等的研究结果。这可能是由于不同产地卤虫遗传多样性不同，对胁迫因子的耐受性也不同。此外，试验条件（水质、光照、盐度、pH值等），试验卤虫活动状态和挑选试验卤虫的随机性等都是引起结果差异的原因。在卤虫养殖上，可参考HCHO SC不超过192.467 mg/L的标准对水体进行消杀，以预防病原微生物感染。

3.3 TCCA对早期卤虫幼体的急剧毒性效应

TCCA是一种有效含氯浓度达30%的广谱杀菌消毒剂，对细菌、真菌、芽孢、病原微生物及病毒均有高效的杀灭作用，在多种水产动物的人工繁育及养殖中应用广泛。罗氏沼虾仔虾SC为0.124 mg/L，凡纳滨对虾幼虾SC为0.15 mg/L。含氯消毒剂在池壁消毒、水体病原微生物杀灭的应用中，效果显著。研究表明，含氯消毒剂、聚维酮碘和碘液（2%）对卵子表面消毒效果均较好，而且不降低卵子活性，但以含氯消毒剂的效果最佳。刘淇等研究得到TCCA对卤虫无节幼体的SC为0.79 mg/L。王兴林研究得到有效氯对卤虫幼体24和48 h LC为2.88和1.99 mg/L，SC为0.097 mg/L。本研究得到TCCA的SC为5.660 mg/L，显著高于刘淇等和王兴林的研究结果。引起结果差异的原因较多，刘淇等所用含消毒剂的有效氯含量为88%，而王兴林试验过程中每间隔24 h 100%更换试验海水，有效氯含量和SC的计算方法不同是分别是导致结果差异的主要原因。因此，可参考不同条件下的TCCA消毒SC，既可以杀灭大多数细菌和病原体，又不影响卤虫幼体生长。