Box-Behnken模型优化油茶饼粕多酚提取工艺及抗氧化活性研究

孙晓波，韦桂凤，王小明，张鹏，覃逸明，郭松

（广西科技师范学院食品与生化工程学院，特色瑶药资源研究与开发重点实验室，广西 来宾 546199）

油茶，山茶科茶属植物，在我国已有2 000多年的种植历史，与油棕、油橄榄、椰子并称为世界四大木本食用油料作物[1-2]。我国油茶种植面积已达460万hm2，主要分布于长江以南省区[3]。油茶果由油茶籽、油茶果皮、油茶籽壳3个部分组成，以油茶籽为原料榨出的茶籽油中含有高达90%的不饱和脂肪酸，同时还含有多糖、茶皂苷、角鲨烯等多种功能性成分，长期食用有利于身体健康[4-5]。油茶籽经榨油后得到的主要副产物为油茶饼粕，如果将每年收获的油茶籽全部用来榨油，可产生近200万吨油茶饼粕。油茶饼粕中茶皂素、茶籽蛋白、黄酮和多酚类物质含量丰富，对大肠杆菌、稻瘟病菌、炭疽病菌、柑橘青霉病菌有较好抑制效果[6]。油茶饼粕多糖具有抗血栓、降血糖、降血压、降血脂等功效[7-8]。油茶饼粕正丁醇萃取相中的抑菌物质为黄酮苷类化合物，具有抑制黄曲霉素的效果[9]。Wang等[10]研究发现油茶饼粕皂苷在体外对人肿瘤细胞有抗增殖活性，并以肝癌H22荷瘤小鼠为实验对象验证了油茶饼粕中总皂苷的抗癌活性。目前，因生产工艺和生产成本限制，油茶饼粕除极少数用于提取茶皂素外，其余大部分都被当做清塘剂或肥料使用，造成资源的极大浪费。

微波辅助提取法具有耗时短、浸提液受热均匀、节省溶剂、操作简便等优势被广泛应用于多糖、黄酮、色素等有效成分的提取，但未见其应用于油茶饼粕中多酚提取的相关报道。因此，本研究采用微波辅助提取油茶饼粕中多酚，经单因素试验和Box–Behnken模型优化油茶饼粕中多酚的最优提取工艺，并验证其抗氧化活性，旨在为油茶饼粕资源的进一步开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶饼粕：市售；L-抗坏血酸（VC）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、没食子酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、无水碳酸钠、水杨酸、七水合硫酸亚铁、30%过氧化氢、盐酸、石油醚（均为分析纯）：四川西陇科学股份有限公司；DPPH（纯度>98%）：凯玛生化有限公司；福林酚（生物试剂）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温鼓风干燥箱（GZX-GF101-3BS）：上海跃进医疗器械有限公司；多功能粉碎机（FW-135）：天津市泰斯特仪器有限公司；紫外-可见分光光度计（UV-9600）：北京瑞利分析仪器有限公司；祥鹄微波合成仪（XH-MC-1）：北京祥鹄科技发展有限公司；循环水多用真空泵（SHZ-D（Ш）：巩义市科瑞仪器有限公司；旋转蒸发仪（R-1001VN）：郑州长城科工贸有限公司；台式高速离心机（H-1850）：湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油茶饼粕预处理

油茶饼粕除去杂质，45℃恒温干燥至恒重，粉碎机粉碎后过80目筛；然后将油茶饼粕粉末用石油醚回流脱脂，过滤得到脱脂油茶饼粕，再次45℃恒温干燥至恒重，经粉碎机粉碎过80目筛后密封袋储存备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

采用福林-酚测定法绘制没食子酸标准曲线[11]。准确移取 0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8、5.6、6.4 mL 没食子酸标准溶液（0.1 mg/mL）分别置于10 mL比色管中，蒸馏水稀释定容得到不同浓度没食子酸溶液。分别移取1.0mL上述不同浓度没食子酸溶液于10 mL比色管中，依次加入5.0 mL蒸馏水、1.0 mL福林酚显色剂，充分振荡后静置6 min，然后加入3.0 mL 7%碳酸钠溶液，摇匀，室温25℃下避光反应2 h，于765 nm波长处测定其吸光度。以没食子酸溶液质量浓度X（mg/L）为横坐标，以吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程Y＝95.938X+0.000 7，R2＝0.999 3。表明在 0.000 8 mg/mL～0.006 4 mg/mL溶度范围内，没食子酸溶液与其吸光度线性关系良好，适用于油茶饼粕多酚提取量的测定。

1.3.3 油茶饼粕多酚的提取及测定

准确称取经1.3.1方法处理后的油茶饼粕粉末1.0 g，在不同微波功率、微波时间、微波温度、乙醇体积分数、液料比条件下微波辅助提取后，减压抽滤并定容至100 mL容量瓶作为油茶饼粕多酚提取液。准确移取1.25 mL多酚提取液稀释定容至10 mL比色管作为待测液备用。准确移取1.0 mL上述待测液于10 mL比色管，按1.3.2方法显色后，765 nm处测定其吸光度，平行测定3次。多酚提取量计算公式如下。

式中：c为稀释后油茶饼粕多酚质量浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；m为油茶饼粕粉末质量，g；N为稀释倍数。

1.3.4 单因素优化试验

分别考察微波功率、微波时间、微波温度、乙醇体积分数、液料比5个因素对油茶饼粕多酚提取量的影响。微波功率选择 300、400、500、600、700 W；微波时间选择 1、3、5、7、9min；微波温度选择 30、40、50、60、70 ℃；乙醇体积分数选择40%、50%、60%、70%、80%；液料比选择 40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1、80 ∶1（mL/g）。

1.3.5 响应面优化试验

基于单因素试验结果，结合单因素方差分析，筛选出4个对多酚提取量影响较大的因素，分别为微波功率（A）、微波时间（B）、微波温度（C）、乙醇体积分数（D）。以上述4个因素为自变量，以油茶饼粕多酚提取量为响应值，进行四因素三水平响应面试验，对多酚提取条件进行进一步的优化。响应面因素及水平见表1。

表1 响应面因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.6 油茶饼粕多酚抗氧化活性评价

参考黎克纯等[12]、裴斐等[13]、宋佳敏等[14]的方法并稍加以修改，对油茶饼粕多酚体外抗氧化活性进行评价，具体评价方法如下。

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的测定

准确移取2.0 mL不同质量浓度的油茶饼粕多酚提取液于10 mL离心管中，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL，摇匀并均匀反应30 min后，于517 nm波长处测定其吸光度A1；固定上述试验条件，用等体积无水乙醇替代DPPH溶液，测定油茶饼粕多酚提取液本底吸光度A2；用等体积无水乙醇替代油茶饼粕多酚提取液，测定其空白吸光度A0，以L-抗坏血酸（VC）溶液作为对照试验，按下式计算DPPH自由基清除率。

1.3.6.2 超氧阴离子自由基清除率的测定

取8支洁净的10 mL离心管，分别加入4.5 mL 50 mmol/L（pH8.2）Tris-HCl缓冲溶液，25℃恒温水浴20 min后立即加入1.0 mL已预热至25℃不同质量浓度的油茶饼粕多酚提取液和0.4 mL 25 mmol/L邻苯三酚溶液，摇匀后再次将离心管置于25℃恒温水浴4 min，取出并立即加入8 mmol/L HCl溶液1.0 mL终止反应，于325 nm波长处测定其吸光度Aβ。固定上述试验条件，用等体积蒸馏水替代油茶饼粕多酚提取液，测定其空白吸光度Aα，以VC溶液作为对照试验，超氧阴离子自由基清除率计算公式如下。

1.3.6.3 羟基自由基清除率的测定

准确移取2.0 mL不同质量浓度的油茶饼粕多酚提取液于10 mL离心管中，依次加入10 mmol/L硫酸亚铁溶液、10 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L过氧化氢溶液各2.0 mL，37℃水浴反应30 min后，于510 nm波长处测定其吸光度As；用等体积蒸馏水替换上述试验中过氧化氢溶液，测定油茶饼粕多酚提取液本底吸光度Ac，用等体积蒸馏水替代油茶饼粕多酚提取液，测定其空白吸光度Ab。以VC溶液作为对照试验，羟基自由基清除率计算公式如下。

1.4 数据处理

每组试验均重复测定3次；采用Excel 2010和SPSS 19.0对数据进行统计及显著性差异分析，采用Origin 2018绘图，采用Design-Expert 8.0.6进行响应面试验设计及分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 微波功率对油茶饼粕多酚提取量的影响

微波功率对油茶饼粕多酚提取量的影响见图1。

图1 微波功率对多酚提取量的影响Fig.1 Effects of microwave power on polyphenols extraction amount

由图1可知，当微波功率为300 W～600 W时，油茶饼粕多酚提取量随着微波功率的增大而显著增加（P<0.05）。这可能是由于增大微波功率会加速植物细胞中极性分子的振动，导致多酚类化合物溶出增多，提取量增加[15]；微波功率为600 W时，多酚提取量达到最大，最大值为39.16 mg/g；当微波功率超过600 W后，油茶饼粕多酚提取量开始显著降低（P<0.05），原因可能是微波功率过大会破坏多酚类化合物的分子结构，因而提取量降低。故选择600 W作为最佳微波功率。

2.1.2 微波时间对油茶饼粕多酚提取量的影响

微波时间对油茶饼粕多酚提取量的影响见图2。

图2 微波时间对多酚提取量的影响Fig.2 Effects of microwave time on polyphenols extraction amount

由图2可知，当微波时间为5 min时，油茶饼粕多酚的提取量达到最大，最大值为40.38 mg/g；与其他微波时间条件下的多酚提取量差异显著（P<0.05）。原因可能是随着微波时间的不断延长，油茶饼粕中多酚类化合物溶出更完全。微波时间为5 min时，多酚类化合物已基本溶出，而过长的微波时间不仅耗能增加，且会引起其他醇溶性杂质溶出增多，导致多酚提取量下降[16]。故选择5 min作为最优微波时间。

2.1.3 微波温度对油茶饼粕多酚提取量的影响

微波温度对油茶饼粕多酚提取量的影响见图3。

图3 微波温度对多酚提取量的影响Fig.3 Effects of microwave temperature on polyphenols extraction amount

由图3可知，当微波温度为30℃～60℃时，油茶饼粕多酚提取量随着微波温度的升高而显著增加（P<0.05），可能原因为体系温度升高导致分子间传质动力增大，多酚的溶解度增大。微波温度为60℃时，多酚提取量达到最大，最大值为40.12 mg/g；当微波温度超过60℃后，油茶饼粕多酚提取量开始显著降低（P<0.05）。这可能是因为温度超过60℃后，油茶饼粕中某些多酚类化合物开始分解，提取量下降[17]。故选择60℃作为最优微波温度。

2.1.4 乙醇体积分数对油茶饼粕多酚提取量的影响

乙醇体积分数对油茶饼粕多酚提取量的影响见图4。

图4 乙醇体积分数对多酚提取量的影响Fig.4 Effects of ethanol concentration on polyphenols extraction amount

由图4可知，当乙醇体积分数为50%时，油茶饼粕多酚的提取量达到最大，最大值为42.00mg/g，与其他乙醇体积分数条件下的多酚提取量差异显著（P<0.05）。原因主要是当乙醇体积分数低于50%时，溶剂极性较大，油茶饼粕多酚不能完全溶解；随着乙醇体积分数的增大，多酚溶出增多；当乙醇体积分数超过50%后，溶剂极性降低导致油茶饼粕中一些其他醇溶性杂质溶出增多，与多酚形成竞争关系，降低了多酚的溶出效果[18]。故选择50%乙醇作为最优提取溶剂。

2.1.5 液料比对油茶饼粕多酚提取量的影响

液料比对油茶饼粕多酚提取量的影响见图5。

图5 液料比对多酚提取量的影响Fig.5 Effects of liquid-material ratio on polyphenols extraction amount

由图5可知，当液料比为 40∶1（mL/g）～70∶1（mL/g）时，油茶饼粕多酚提取量随着液料比的增大也显著增加（P<0.05），原因主要是随着液料比的不断增大，油茶饼粕粉末与乙醇溶液接触更加充分，多酚类化合物溶出增多，提取量增加；液料比为70∶1（mL/g），多酚提取量达到最大，最大值为42.19 mg/g；当液料比超过70∶1（mL/g）后，油茶饼粕多酚提取量开始显著降低（P<0.05），这主要是由于液料比过大时，一些其它醇溶性物质溶解性也增大，从而抑制了油茶饼粕多酚的溶出，且液料比过大会导致溶剂的浪费[19-20]。综合考虑，选择70∶1（mL/g）作为最优液料比。

2.2 响应面优化

2.2.1 响应面试验结果与分析

以油茶饼粕多酚提取量为响应值，按照Box-Behnken设计原理设计四因素三水平响应面试验，试验结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface methodology

续表2 响应面试验设计与结果Continue table 2 Design and results of response surface methodology

通过Design expert 8.0.6软件对表2数据进行二次多元回归分析，得到油茶饼粕多酚提取量与各因素的二次多元回归方程为Y=42.05+0.80A+1.08B+0.73C-1.09D-0.75AB+0.14AC+1.02AD+0.71BC-0.37BD-0.12CD-2.16A2-2.58B2-1.58C2-2.97D2，方差分析及显著性检验见表3。

表3 方差分析及显著性检验Table 3 Variance analysis and significance test

由表3可知，模型F值为29.17，P值<0.000 1，说明模型极显著；失拟项P值为0.226 4，不显著（P>0.05）；相关系数R2=0.966 9，说明该模型能够很好的预测出多酚提取量。A（微波功率）、B（微波时间）、C（微波温度）、D（乙醇体积分数）4个因素对油茶饼粕多酚提取量均有极显著影响（P<0.01）；交互项AD有极显著影响（P<0.01），AB、BC 有显著影响（P<0.05），AC、BD、CD 间无显著性影响；二次项 A2、B2、C2、D2均达到极显著水平（P<0.01）。从表3中F值大小可知，各因素影响重要性依次为乙醇体积分数＞微波时间＞微波功率＞微波温度。

2.2.2 各因素交互作用分析

各因素间响应面和等高线图见图6。

图6 各因素交互作用对油茶饼粕多酚提取量的影响Fig.6 Effects of interactions factors on polyphenols extraction amount from Camellia seed cake

由图6可知，各因素对油茶饼粕多酚提取量的影响反映在响应面曲面的陡峭程度上，响应面曲面弧度变化越陡峭，说明该因素对提取量的影响越敏感；反之则不敏感[21]。乙醇体积分数曲面较其他因素曲面陡峭，说明乙醇体积分数对油茶饼粕多酚提取量影响较为明显。在有交互作用的影响下，微波功率和乙醇体积分数交互影响作用极显著，微波功率和微波时间、微波时间和微波温度交互影响作用显著，微波功率和微波温度、微波时间和乙醇体积分数、微波温度和乙醇体积分数交互影响作用不显著，这与表3分析结果一致。

2.2.3 验证试验

通过响应面模型预测出油茶饼粕多酚最佳提取工艺条件为微波功率610.61 W、微波时间5.50 min、微波温度63℃、乙醇体积分数48.13%、液料比70∶1（mL/g），此条件下油茶饼粕多酚理论提取量为42.44 mg/g。考虑到试验操作的可实施性，将工艺条件调整为微波功率600 W、微波时间5.5 min、微波温度63℃、乙醇体积分数 48%、液料比 70∶1（mL/g），此条件下，油茶饼粕多酚的实际提取量为42.29 mg/g，相对标准偏差仅为0.42%，与理论提取量相近，说明模型有效。

2.3 油茶饼粕多酚抗氧化活性评价

2.3.1 DPPH自由基清除率的测定

DPPH自由基清除率的测定见图7。

图7 油茶饼粕多酚提取液对DPPH自由基清除率的影响Fig.7 Effects of polyphenols from Camellia seed cake on the scavenging rate of DPPH radicals

由图7可知，油茶饼粕多酚、VC对DPPH自由基的清除率均随着浓度的增大而增大，当溶度为0.07 mg/mL时，油茶饼粕多酚对DPPH自由基的清除率达到83.76%，相同浓度下VC清除率为89.86%。油茶饼粕多酚浓度在0.06 mg/mL～0.07 mg/mL范围内，对DPPH自由基清除率不存在显著差异（P>0.05），说明继续增大多酚浓度，清除率升高不再显著。经拟合得出油茶饼粕多酚对DPPH自由基的半抑制浓度（IC50）为0.029 mg/mL，VC的IC50为0.024 mg/mL，说明油茶饼粕多酚对DPPH自由基的清除能力与VC相近。

2.3.2 超氧阴离子自由基清除率的测定

超氧阴离子自由基清除率的测定见图8。

图8 油茶饼粕多酚提取液对超氧阴离子自由基清除率的影响Fig.8 Effects of polyphenols from Camellia seed cake on the scavenging rate of superoxide anion radicals

由图8可知，在低浓度范围内，油茶饼粕多酚对超氧阴离子自由基的清除率远远大于VC，随着浓度的增大，油茶饼粕多酚、VC对超氧阴离子自由基的清除率也不断增大且两者差值逐步缩小；当溶度为0.8 mg/mL时，油茶饼粕多酚、VC对超氧阴离子自由基的清除率分别为83.38%、82.02%。油茶饼粕多酚浓度为0.7 mg/mL～0.8 mg/mL时，对超氧阴离子自由基清除率不存在显著差异（P>0.05），说明继续增大多酚浓度，清除率升高不再显著。经拟合得出油茶饼粕多酚对超氧阴离子自由基的IC50为0.23 mg/mL，VC的IC50为0.48 mg/mL，说明油茶饼粕多酚对超氧阴离子自由基的清除能力较VC强。

2.3.3 羟基自由基清除率的测定

羟基自由基清除率的测定见图9。

图9 油茶饼粕多酚提取液对羟基自由基清除率的影响Fig.9 Effects of polyphenols from Camellia seed cake on the scavenging rate of hydroxyl radicals

由图9可知，随着油茶饼粕多酚、VC浓度的不断增大，其对羟基自由基的清除率也不断增大，但油茶饼粕多酚对羟基自由基的清除率增势较VC平缓。油茶饼粕多酚溶度为0.8 mg/mL时，对羟基自由基的清除率达到34.96%，而相同浓度下VC的清除率高达99.74%，说明油茶饼粕多酚清除羟基自由基的能力较VC弱。

3 结论

本研究基于单因素试验结果，通过Box-Behnken模型优化油茶饼粕多酚的微波辅助提取工艺，确定微波功率600 W、微波时间5.5 min、微波温度63℃、乙醇体积分数48%、液料比70∶1（mL/g）为最优提取工艺条件，此条件下，油茶饼粕多酚的实际提取量为42.29 mg/g，与预测值拟合效果好。在试验所选浓度范围内，油茶饼粕多酚对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的最高清除率分别为83.76%、83.38%、34.96%，表现出较好的体外抗氧化活性。本研究为油茶饼粕多酚的生产以及油茶饼粕抗氧化活性成分应用于功能性食品开发提供理论依据。